胡增祥 杜昱蕾 劉全喜 王媛 李亮

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近年肺癌的發(fā)病率和死亡率都有明顯的增高趨勢(shì)[1]。氧化應(yīng)激反應(yīng)與肺癌的發(fā)生相關(guān)。由于多環(huán)芳烴會(huì)產(chǎn)生活性氧，以及代謝成毒性中間體，可以通過(guò)檢測(cè)過(guò)氧化氫酶（catalase, CAT）活性以反映氧化應(yīng)激相關(guān)的信號(hào)。丙二醛（malondialdehyde, MDA）是脂質(zhì)過(guò)氧化物的代謝產(chǎn)物。P38MAPK是MAPK家族的重要成員之一，在、應(yīng)激狀態(tài)下，與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。已有文獻(xiàn)報(bào)道了蛇毒[2,3]、蜂毒[4,5]和蝎毒[6]的抗腫瘤作用。目前尚無(wú)關(guān)于雷氏大疣蛛蜘蛛毒素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的作用的報(bào)道。因此，本研究旨在通過(guò)檢測(cè)雷氏大疣蛛蜘蛛毒素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞增殖、CAT、MDA及P38MAPK表達(dá)的影響，為探討大疣蛛蜘蛛毒素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的作用機(jī)理，有助于探究雷氏疣蛛蜘蛛毒素的抗腫瘤效應(yīng)，為其是否有可能成為治療肺癌的新的多肽類藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 通過(guò)電刺激法采集純的雷氏大疣蛛雷氏大疣蛛蜘蛛毒素。使用前將雷氏大疣蛛蜘蛛毒素凍干并置于-80oC環(huán)境中。將雷氏大疣蛛蜘蛛毒素溶于緩沖溶液PBS中并離心（1 000 g, 10 min），去除不溶物質(zhì)。臨時(shí)配制不同實(shí)驗(yàn)的試驗(yàn)溶液，通過(guò)用DMEM稀釋原液將毒素調(diào)整至最終濃度為0 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL。PBS用作陰性對(duì)照。DDP購(gòu)自Sigma有限公司。

人肺腺癌細(xì)胞A549來(lái)源于美國(guó)ATCC（American Type Culture Collection）。用含10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基，其內(nèi)加入2 mmol/L的谷氨酰胺+0.05 mmol/L 2-巰基乙醇（2ME）+10%胎牛血清。保持細(xì)胞濃度為2×105/mL-9×105/mL，在37oC、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)。甘油作為其冷凍保護(hù)劑。2.5 g/L胰酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。首先將細(xì)胞在10%FCS中培養(yǎng)2天。然后每2天通過(guò)離心、洗滌6次且傳代的方式收集細(xì)胞。

將處理過(guò)的雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用到A549細(xì)胞。在處理和控制細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，再將其收獲進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)中的所有數(shù)據(jù)至少出自3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，均顯示出同樣的表達(dá)模式。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)雷氏大疣蛛蜘蛛毒素的細(xì)胞毒性 細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法[8]檢測(cè)。將A549細(xì)胞種在96孔板中，100 mL培養(yǎng)基中1×104個(gè)細(xì)胞。24 h后，用200 mL PBS取代96孔板中的培養(yǎng)基并且加入不同濃度的雷氏大疣蛛蜘蛛毒素（8 μg/mL, 16 μg/mL, 32 μg/mL），DDP作為陽(yáng)性對(duì)照和PBS作為陰性對(duì)照。細(xì)胞在37oC環(huán)境下培養(yǎng)48 h。每個(gè)孔加入50 mL的MTT溶液。培養(yǎng)4 h后，樣品溶于二甲基亞砜（DMSO）中，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品吸光度，測(cè)定波長(zhǎng)492 nm，參考波長(zhǎng)690 nm。OD值表示出試驗(yàn)組和對(duì)照組的光密度。 重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。采用線性分析確定IC50值。

1.2.2 CAT活性的檢測(cè) 以過(guò)氧化氫為底物，用紫外分光光度法測(cè)定其被CAT降解量，間接計(jì)算CAT活力。過(guò)氧化氫酶降解率（240 nm測(cè)量）用來(lái)檢測(cè)雷氏大疣蛛蜘蛛毒素處理細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞的過(guò)氧化氫酶活性的變化[9]。

1.2.3 MDA含量的檢測(cè) 脂質(zhì)過(guò)氧化水平，通過(guò)MDA含量來(lái)檢測(cè)，用硫代巴比妥酸（TBA）方法[10,11]。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 A549細(xì)胞調(diào)整為5×105/mL的細(xì)胞濃度。孵育48 h后，用雷氏大疣蛛蜘蛛毒素處理的細(xì)胞與未經(jīng)雷氏大疣蛛蜘蛛毒素處理的細(xì)胞進(jìn)行平行對(duì)照。細(xì)胞用70%乙醇收集并懸浮，4oC，1 h。用胰蛋白酶進(jìn)行收集并用PBS液沖洗3次。將懸浮顆粒置于250 mL PBS和100 mL Annexin V/PI溶液中。在避光室溫情況下碘化染色30 min，細(xì)胞懸浮液通過(guò)流式細(xì)胞儀（BD公司，美國(guó)）進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定細(xì)胞周期，觀察G1期、G2期、S期各期細(xì)胞所占的百分比，觀察是否存在凋亡峰。通過(guò)WinMDI 2.5版本軟件（TSRI流式細(xì)胞術(shù)）來(lái)分析。

1.2.5 Western blot檢測(cè)P38MAPK的表達(dá)[12]通過(guò)緩沖液裂解制備A549全細(xì)胞裂解液，緩沖液中含有1%Nonidet P-40、乙磺酸50 mmol/L（pH7.5）、氯化鈉100 mmol/L，EDTA 2 mmol/L、焦磷酸緩沖液1 mmol/L、原釩酸鈉10 mmol /L、苯甲基磺酰氟1 mmol/L以及氟化鈉100 mmol/L。相同濃度的裂解液與十二烷基硫酸鈉反應(yīng)-10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用轉(zhuǎn)移緩沖液（Tris 25 mmol/L，甘氨酸192 mmol/L，甲醇10%[v/v]）將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜用Tris緩沖液（TBS: Tris 0.5 mol/L pH7.6, Nacl 0.15 mol/L）沖洗，并用TBS-5%牛血清白蛋白（BSA）在室溫下過(guò)夜，含有抗體的TBS-5%BSA孵育。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（Kirkegaard & Perry Labo-ratories）顯色進(jìn)行檢測(cè)P38MAPK的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)用Mean±SD表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素抑制A549細(xì)胞增殖 通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的回歸方程算出24 h雷氏大疣蛛蜘蛛毒素對(duì)A549細(xì)胞的IC50為12 μg/mL。隨著濃度范圍從8 μg/mL到32 μg/mL，抑瘤率（growth inhibitory rate, GIR）呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性（圖1）。

2.2 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素對(duì)A549細(xì)胞中CAT活性和MAD含量的影響 在雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用的細(xì)胞中檢測(cè)到CAT活性和MDA的形成增加（圖2，圖3），但無(wú)濃度依賴性（P＞0.05）。可見，雷氏大疣蛛蜘蛛毒素參與氧化應(yīng)激可能是通過(guò)增加CAT活性和MAD含量，從而引起對(duì)A549細(xì)胞的毒性作用。

2.3 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素誘導(dǎo)的G2/M期細(xì)胞周期阻滯 如圖4中所示，細(xì)胞周期在48 h周期中連續(xù)進(jìn)行。隨著雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用時(shí)間的延長(zhǎng)，與陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例明顯減少，S期細(xì)胞減少，G2期細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞阻滯在G2/M期。

2.4 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素對(duì)A549細(xì)胞中P38MAPK蛋白表達(dá)的影響 由圖5可見，隨著雷氏大疣蛛蜘蛛毒素濃度的增加，A549細(xì)胞中P38MAPK蛋白表達(dá)逐漸降低?？梢?，雷氏大疣蛛蜘蛛毒素抑制A549細(xì)胞增殖可能與P38MAPK激酶表達(dá)含量降低有關(guān)。

圖 1 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素抑制A549細(xì)胞增殖Fig 1 The inhibition of A549 cells proliferation by spider venom

圖 2 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素增加A549細(xì)胞CAT活性Fig 2 Spider venom increased activity of CAT in A549 cell

圖 3 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素增加A549細(xì)胞MAD含量Fig 3 Spider venom increased MAD content in A549 cell

圖 5 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素減少A549細(xì)胞中P38MAPK蛋白表達(dá)Fig 5 Spider venom reduced expression of P38MAPK in A549 cells

圖 4 雷氏大疣蛛蜘蛛毒素誘導(dǎo)的G2/M期細(xì)胞周期阻滯。A：雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用A549細(xì)胞前；B：雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用A549細(xì)胞后。Fig 4 The cell cycle distribution of A549 cells by the spider venom. A: before treated by the spider venom； B: after treated by the spider venom.

3 討論

中國(guó)是一個(gè)肺癌高發(fā)的危險(xiǎn)區(qū)。原發(fā)性肺癌治療仍然困難，依賴于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究成果。最近的研究[13,14]結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡和周期的改變與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

本研究結(jié)果表明，在A549細(xì)胞經(jīng)雷氏大疣蛛蜘蛛毒素24 h作用后，濃度依賴性誘導(dǎo)凋亡。通過(guò)MTT法測(cè)定雷氏大疣蛛蜘蛛毒素在0 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL和32 μg/mL劑量時(shí)顯著抑制了A549細(xì)胞增殖。在雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用的細(xì)胞中檢測(cè)到CAT活性和MDA的形成增加，但無(wú)濃度依賴性。隨著雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可能是由于G2/M期細(xì)胞周期的阻滯，并出現(xiàn)一明顯的凋亡峰。雷氏大疣蛛蜘蛛毒素可能通過(guò)抑制P38MAPK的表達(dá)發(fā)揮其誘導(dǎo)凋亡作用。據(jù)報(bào)道MAPK激酶特別是P38蛋白激酶在雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的途徑上發(fā)揮重要作用[15]。P38MAPK激酶對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡的影響符合這些結(jié)論[16]。P38MAPK蛋白表達(dá)的改變也顯示了經(jīng)雷氏大疣蛛蜘蛛毒素作用后的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)表達(dá)的模式，意味著雷氏大疣蛛蜘蛛毒素有可能作為一個(gè)化學(xué)預(yù)防藥物對(duì)肺癌進(jìn)行治療和預(yù)防。

令人感興趣的是，P38MAPK表達(dá)的減少是由雷氏大疣蛛蜘蛛毒素引起的，但是整個(gè)細(xì)胞周期的上下游各種蛋白的協(xié)調(diào)和結(jié)合尚未被完全檢測(cè)。因此，其詳盡機(jī)理有待在今后的細(xì)胞周期調(diào)控中繼續(xù)探索。