程妮 韓福才 王艷峰 麥羨霞 蘇文

腫瘤免疫編輯學(xué)說[1,2]認(rèn)為機(jī)體的免疫系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞之間存在著相互作用：免疫系統(tǒng)重塑腫瘤細(xì)胞的抗原性；腫瘤細(xì)胞改變免疫效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。其中在抗腫瘤免疫中，活化性受體NKG2D為近幾年來研究的熱點(diǎn)之一。它在所有的NK細(xì)胞、大多數(shù)NKT細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和γδ+T細(xì)胞表面均有表達(dá)，另外NKG2D也存在于CD8+T細(xì)胞表面[3]。其配體之一是主要組織相容性復(fù)合體I類相關(guān)分子A（major histocompatibility complex class I chainrelated A, MICA）。靶細(xì)胞表面NKG2D的配體與淋巴細(xì)胞表面NKG2D的結(jié)合可以激活淋巴細(xì)胞殺傷表達(dá)NKG2D配體的腫瘤細(xì)胞[4]。因此，NKG2D在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。CD3+CD56+NKT細(xì)胞作為一類新的細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞，兼有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性廣譜殺瘤作用。但是人們對(duì)活化受體NKG2D的認(rèn)識(shí)僅局限于NK細(xì)胞及T細(xì)胞，該受體在NKT細(xì)胞表面的表達(dá)情況及其與肺癌臨床生物學(xué)關(guān)系尚不明了。本研究旨在對(duì)CD8+NKT細(xì)胞表面活化性受體NKG2D在肺癌患者外周血中的表達(dá)水平及其臨床意義進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組選取2009年11月-2010年5月山西省腫瘤醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的初治肺癌患者82例，年齡43歲-69歲，中位年齡54歲。入選標(biāo)準(zhǔn)為具有完整臨床、病理資料、經(jīng)病理或細(xì)胞學(xué)、影像學(xué)檢查確診的肺癌患者，所有患者均無免疫相關(guān)性疾病和其它腫瘤病史，且無使用激素類藥物及免疫抑制劑史。根據(jù)UICC國(guó)際TNM標(biāo)準(zhǔn)2009分類，Ia期-IIb期肺癌患者22例，IIIa期-IIIb期肺癌患者28例，IV期肺癌患者32例。根據(jù)病理分型分類，鱗癌45例，腺癌37例（不研究小細(xì)胞癌）。對(duì)照組來自體檢職工部分志愿者45例，其中男25例，女20例，年齡40歲-67歲，中位年齡52歲。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 抗CD3-PerCP、抗CD8-PE、抗CD56-FITC、抗NKG2D-APC四種熒光素直接標(biāo)記的抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司；sMICA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒為德國(guó)IMMATRICS Biotechnologies產(chǎn)品；裂解液購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司；PBS磷酸鹽緩沖液（pH=7.2-7.4）；Sunrise全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)自奧地利Tacan公司；FACSAria流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；KDC-1044低速離心機(jī)購(gòu)自科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司。

1.2 方法 采用四色免疫熒光染色（CD3-PerCP/CD8-PE/CD56-FITC/NKG2D-APC）方法檢測(cè)受體NKG2D在CD8+NKT細(xì)胞表面的表達(dá)水平。治療前抽取患者空腹靜脈血2 mL于EDTA鉀鹽抗凝的真空采血管中，輕輕搖勻后備用。取熒光標(biāo)記的單克隆抗體20 μL加入EP管中，設(shè)相應(yīng)的同型對(duì)照，加入EDTA鉀鹽抗凝全血100 μL，充分混勻，室溫避光孵育20 min；同時(shí)加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，混勻后避光孵育10 min，離心7 min（1 500 rpm），棄去上清；加入2 mL PBS洗滌液后離心7 min（1 500 rpm），棄去上清，重復(fù)2次，棄去上清PBS，將洗滌液混勻，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，采用Diva軟件分析獲取細(xì)胞。sMICA根據(jù)試劑盒提供的操作方法測(cè)定，以波長(zhǎng)450 nm檢測(cè)結(jié)果。測(cè)定sMICA水平的樣本獲取：取靜脈血2 mL-3 mL于無抗凝真空采血管中，待血液凝固后，2 000 rpm，離心10 min，取血清于1.5 mL的EP管中，-20oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。結(jié)果用Mean±SD表示。各實(shí)驗(yàn)組之間表達(dá)水平差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或One-Way ANOVA進(jìn)行分析；雙變量相關(guān)性分析根據(jù)變量是否符合正態(tài)分布采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組健康人群與肺癌患者外周血CD8+NKT細(xì)胞受體NKG2D表達(dá)情況 與對(duì)照組健康人群相比，患者外周血中CD8+NKT細(xì)胞受體NKG2D的表達(dá)下降（P＜0.001）（表1，圖1）。

2.2 肺癌患者外周血CD8+NKT細(xì)胞受體NKG2D與生物學(xué)特征之間的關(guān)系 與非吸煙患者相比，吸煙患者外周血中CD8+NKT細(xì)胞受體NKG2D的表達(dá)下降（P＜0.05）。CD8+NKT細(xì)胞受體NKG2D的表達(dá)與病理類型、性別、年齡無關(guān)（P＞0.05）。隨著TNM分期的增加，NKG2D的表達(dá)率逐漸降低。其中IV期肺癌患者NKG2D的表達(dá)低于I期-II期及III期患者該受體的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（表2）。

2.3 外周血CD8+NKT細(xì)胞受體NKG2D與sMICA的相關(guān)性經(jīng)線性相關(guān)分析表明，外周血CD8+NKT細(xì)胞受體NKG2D和sMICA呈線性負(fù)相關(guān)（r=-0.598, P＜0.001）（圖2）。

表 1 正常人和肺癌患者外周血CD8+NKT細(xì)胞受體NKG2D表達(dá)水平Tab 1 NKG2D expression levels in CD8+ NKT cell of normal subjects and lung cancer patients

圖 1 對(duì)照組健康人和肺癌患者CD8+NKT細(xì)胞受體NKG2D流式細(xì)胞散點(diǎn)圖Fig 1 Scatter plots about NKG2D-expressing CD8+NKT cells which was measured by flow cytometry for healthy controls and lung cancer patients

表 2 肺癌患者外周血CD8+NKT細(xì)胞受體NKG2D表達(dá)與一般生物學(xué)特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between the expression of NKG2D-expressing CD8+NKT cells and biological characteristics of advanced lung cancer patients

圖 2 外周血CD8+NKT細(xì)胞表面受體NKG2D與SMICA負(fù)性相關(guān)散點(diǎn)圖Fig 2 Scetter Plots about sMICA levers and the number of NKG2D-expressing CD8+NKT cells which are negatively corrected

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)尤其是細(xì)胞免疫密切相關(guān)。因此，隨著多學(xué)科治療模式的逐步形成，免疫治療作為繼手術(shù)、化療及放療后第四種腫瘤治療手段受到人們的廣泛重視。自然殺傷性T細(xì)胞（natural killer T cell, NKT）是一類在機(jī)體早期抗腫瘤免疫機(jī)制中起重要作用的效應(yīng)T細(xì)胞，作為機(jī)體抗腫瘤的第一道防線，其在抵抗腫瘤和病毒感染過程中起關(guān)鍵作用。NKT細(xì)胞以CD3+CD56+為生物學(xué)特征。根據(jù)CD4、CD8的表達(dá)與否，NKT細(xì)胞分為CD4+NKT、CD8+NKT和（CD4-CD8-）DN三個(gè)亞群[5]。NKT細(xì)胞通過識(shí)別由非經(jīng)典的MHC-I類分子（CD1d）遞呈的糖脂類抗原活化并迅速分泌大量TH1和TH2類細(xì)胞因子[6,7]。NKG2D是自然殺傷性T細(xì)胞重要的激活性受體，它通過識(shí)別靶細(xì)胞（多為腫瘤細(xì)胞）表面的配體MICA，并與之結(jié)合傳遞活化信號(hào)，繼而激活免疫效應(yīng)細(xì)胞（包括NKT細(xì)胞）對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。因此NKG2D的表達(dá)是機(jī)體抗腫瘤免疫的關(guān)鍵因素。sMICA是由于腫瘤細(xì)胞的死亡、MICA分泌和金屬蛋白酶水解而脫落至外周血中的MICA。sMICA降低了腫瘤表面MICA分子的表達(dá)水平，而且它還能誘導(dǎo)NKT細(xì)胞表面和NK細(xì)胞表面受體NKG2D發(fā)生內(nèi)化降解，導(dǎo)致NKT細(xì)胞和NK細(xì)胞NKG2D的下調(diào)，抑制免疫細(xì)胞殺傷活性，導(dǎo)致腫瘤逃逸[8]。

CD8+NKT細(xì)胞表面表達(dá)NKG2D的同時(shí)，NK細(xì)胞也表達(dá)CD56，因此本研究對(duì)NKG2D表達(dá)的流式細(xì)胞結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)，選擇CD3+CD56+的細(xì)胞群，有效避免了NK細(xì)胞（CD3-CD56+）的干擾，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果表明NKG2D發(fā)揮免疫正調(diào)節(jié)作用。Cristina等[9]研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤患者及結(jié)直腸癌患者免疫細(xì)胞受腫瘤細(xì)胞的編輯，其細(xì)胞表面的活化性受體NKG2D表達(dá)下降時(shí)，NKT細(xì)胞的殺傷活性降低；CD8+NKT細(xì)胞表面受體NKG2D的表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組，同時(shí)其配體sMICA高于健康對(duì)照組；外周血sMICA上調(diào)介導(dǎo)的NKT細(xì)胞活化受體NKG2D的下調(diào)機(jī)制參與了以腫瘤為中心抑制免疫網(wǎng)絡(luò)的形成，與機(jī)體免疫狀態(tài)有著密切聯(lián)系，可作為監(jiān)視腫瘤患者免疫功能的參考指標(biāo)，也可作為評(píng)估腫瘤發(fā)生發(fā)展的參考依據(jù)。

肺癌患者細(xì)胞免疫處于抑制狀態(tài)，而機(jī)體的免疫狀態(tài)與腫瘤的侵襲及演進(jìn)有關(guān)。NKG2D表達(dá)的檢測(cè)可作為評(píng)價(jià)肺癌細(xì)胞免疫狀態(tài)的指標(biāo)，在肺癌免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果表明，與健康對(duì)照組人群相比，肺癌患者外周血中CD8+NKT細(xì)胞表面NKG2D受體的表達(dá)水平較低（P＜0.001）。筆者認(rèn)為肺癌患者外周血NKT細(xì)胞表面受體NKG2D下調(diào)的原因可能是：①血清高表達(dá)sMICA誘導(dǎo)了NKT細(xì)胞表面的NKG2D發(fā)生內(nèi)化降解[10]；②與腫瘤分泌有關(guān)的一些免疫抑制細(xì)胞因子如TGF-β有關(guān)[11]；③可溶性抗原sMICA可作為封閉因子封閉效應(yīng)NKT細(xì)胞表面受體NKG2D，阻止NKT細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，由于其結(jié)合位點(diǎn)被占用，因此使用流式細(xì)胞儀無法檢測(cè)到這部分受體的存在，導(dǎo)致所測(cè)NKT細(xì)胞表面受體NKG2D水平降低。④肺癌細(xì)胞表面脫落的sMICA反過來可以下調(diào)NKG2D受體的表達(dá)而產(chǎn)生肺癌免疫逃逸。

腫瘤的免疫治療建立在免疫系統(tǒng)的監(jiān)視功能的基礎(chǔ)上，即免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別腫瘤細(xì)胞并將其殺死。本研究結(jié)果表明，肺癌患者外周血中CD8+NKT細(xì)胞表面NKG2D受體的表達(dá)較健康人群低（P＜0.001），同時(shí)該受體的表達(dá)與吸煙、臨床分期相關(guān)（P＜0.05），且隨著臨床分期的增加，NKG2D的表達(dá)逐漸降低。其中I期-II期及III期肺癌患者NKG2D的表達(dá)均明顯高于IV期患者該受體的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），但它與肺癌病理分型、年齡及性別無關(guān)（P＞0.05），說明外周血中CD8+NKT細(xì)胞表面NKG2D受體與肺癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。研究同時(shí)表明，外周血CD8+NKT細(xì)胞受體NKG2D和其配體sMICA呈線性負(fù)相關(guān)，間接證實(shí)肺癌患者血清sMICA升高介導(dǎo)NKG2D下調(diào)的腫瘤免疫逃逸機(jī)制，而其中NKG2D發(fā)揮免疫正調(diào)節(jié)作用。綜上所述可能由于其表面NKG2D受體表達(dá)的下降，肺癌患者體內(nèi)NKT細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的反應(yīng)性降低，因此不能對(duì)肺癌細(xì)胞進(jìn)行有效地殺傷，同時(shí)表面MICA/B配體的表達(dá)而逃逸NKT細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。肺癌細(xì)胞也可能通過減少其上調(diào)介導(dǎo)NKT細(xì)胞活化受體NKG2D下調(diào)機(jī)制參與了晚期肺癌以腫瘤為中心抑制免疫網(wǎng)絡(luò)的形成，與機(jī)體免疫狀態(tài)有著密切聯(lián)系，可作為監(jiān)視晚期肺癌患者免疫功能的參考指標(biāo)，也可作為評(píng)估肺癌發(fā)生發(fā)展的參考依據(jù)。但以N KG2D-MICA為基礎(chǔ)的免疫監(jiān)視功能在肺癌患者中如何發(fā)揮作用、如何誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞表面MICA/B的表達(dá)、如何減少膜性MIC的脫落以及如何上調(diào)NKG2D的表達(dá)以恢復(fù)NKT細(xì)胞的活性值得深入研究。