劉宇 譚金晶 李琳 李碩 鄒霜梅 張瑩 張曉靜 凌兵 韓迺珺 郭素萍 高燕寧

肺癌嚴(yán)重危害人類健康與生命。2008年美國(guó)肺癌新增病例數(shù)及死亡病例數(shù)分列各種腫瘤的第二位及第一位[1]。中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生部公布的資料[2]顯示，在過(guò)去30年間肺癌死亡率上升了465%，已經(jīng)成為我國(guó)惡性腫瘤死亡的首位原因。肺癌的發(fā)生是基因與環(huán)境相互作用的結(jié)果，其中涉及到多種癌基因的激活與抑癌基因的失活[3,4]。本實(shí)驗(yàn)室利用基因芯片技術(shù)對(duì)82例肺鱗癌患者的腫瘤組織與配對(duì)癌旁組織的mRNA表達(dá)譜分析顯示，dlk1基因在肺鱗癌中表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織（尚未發(fā)表的資料），提示dlk1基因可能在肺鱗癌的發(fā)生演進(jìn)過(guò)程中起促進(jìn)作用，值得深入研究。

dlk1基因別名FA1、ZOG、Pref-1，定位于人14號(hào)染色體長(zhǎng)臂14q32，編碼含383個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)DLK1，屬父源性印跡基因。DLK1蛋白由N端的信號(hào)肽，6個(gè)EGF結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域及C端的胞內(nèi)肽段組成，屬于表皮生長(zhǎng)因子類家族蛋白，與Notch/Delta/Serrate蛋白具有一定的同源性。其蛋白結(jié)構(gòu)與其同源蛋白DLL1相比，缺少N端的DSL結(jié)構(gòu)域[5]。dlk1基因在大部分成體動(dòng)物組織中處于沉默狀態(tài)。根據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genecards.org/）中基因表達(dá)序列分析（Serial Analysis of Gene Expression）數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)dlk1基因在人不同組織中的表達(dá)，結(jié)果表明，該基因在胎盤(pán)組織高表達(dá)，而在大部分正常組織中均不表達(dá)。最近的研究發(fā)現(xiàn)，dlk1基因在多種腫瘤中出現(xiàn)異常表達(dá)，如在腦膠質(zhì)瘤、肝癌組織中表達(dá)水平均高于正常組織[6,7]；且dlk1在肝癌中的高表達(dá)與肝癌病人預(yù)后不良相關(guān)[8]。而在腎癌中dlk1基因較正常組織低表達(dá)[9]。目前，dlk1基因與肺鱗癌的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究入組病例均為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院胸外科收治的肺癌患者，術(shù)前均未接受放射治療或化學(xué)治療。全部患者均接受了規(guī)范的肺癌根治手術(shù)及區(qū)域淋巴結(jié)清掃治療。組織病理學(xué)診斷依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟（International Union Against Cancer, UICC）2002年標(biāo)準(zhǔn)。人肺鱗癌細(xì)胞株H520源自美國(guó)ATCC；真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Myc（His）購(gòu)自Invitrogen公司；DLK1抗體購(gòu)自Abcam公司；CyclinB1抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；Cell Counting Kit-8（CCK8）試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肺鱗癌細(xì)胞H520在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37oC、5%CO2條件下常規(guī)貼壁培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合度達(dá)80%左右時(shí)，以含0.2%EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行常規(guī)傳代。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR） 提取組織或細(xì)胞總RNA，取1 μg總RNA按照Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取1 μL反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。dlk1引物F：5'-AAGGACTGCCAGAAAAAGGAC-3'，R：5'-GCAGAAATTGCCTGAGAAGC-3'；產(chǎn)物長(zhǎng)度138 bp。18s引物F：5'-GAAACGGCTACCACATCC-3'，R：5'-ACCAGACTTGCCCTCCA-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度167 bp，退火溫度均為60oC。

1.2.3 dlk1基因的克隆和真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中dlk1基因mRNA序列信息（Accession Number: NM_003836.4）設(shè)計(jì)克隆引物，在上游引物中含有NheI酶切位點(diǎn)，下游引物含有HindIII酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增dlk1基因全長(zhǎng)開(kāi)放讀碼框（ORF）。產(chǎn)物經(jīng)純化、酶切后，連進(jìn)入真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His(-)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并篩選獲得成功轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性克隆進(jìn)行后續(xù)鑒定。dlk1克隆引物F：5'-CCCAAGCTTGGGGATCTCCTCGTCGCCG-3'，R：5'-CCCAAGCTTGGGGATCTCCTCGTCGCCG-3'；產(chǎn)物長(zhǎng)度1 257 bp，采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，退火及延伸溫度均為72oC。

1.2.4 脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按LipofectamineTM2000產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%-90%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將混勻的質(zhì)粒與脂質(zhì)體加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37oC、5%CO2條件下培養(yǎng)。并于4 h-6 h后更換新鮮培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，培養(yǎng)基中加入G418（500 μg/mL）篩選穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞，分別命名為H520-dlk1及H520-pcdb。

1.2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 參照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將一定數(shù)量的細(xì)胞種于96孔板中，37oC常規(guī)培養(yǎng)，并記為第0天。測(cè)定細(xì)胞活性時(shí)，按照100 μL培養(yǎng)基加入10 μL CCK8溶液的比例稀釋CCK8；更換細(xì)胞培養(yǎng)基后，將稀釋好的CCK8溶液加入孔板中；37oC培養(yǎng)2 h，并于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。

1.2.6 Western blot分析 采用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，BCA Protein Assay Kit對(duì)蛋白進(jìn)行定量。取80 μg變性后的蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所用抗DLK1抗體及抗CyclinB1的抗體稀釋度分別為1:100及1:1 000，并用ECL發(fā)光試劑檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用R統(tǒng)計(jì)分析平臺(tái)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 dlk1基因在肺癌組織中的表達(dá) 通過(guò)RT-PCR方法在30例非小細(xì)胞肺癌（其中鱗癌16例，腺癌14例）患者的組織及其配對(duì)癌旁正常組織中檢測(cè)了dlk1基因mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，dlk1基因在36.7%（11/30）的非小細(xì)胞肺癌組織中較癌旁組織高表達(dá)（圖1，差異表達(dá)倍數(shù)≥2.0）。

圖 1 dlk1基因在30例非小細(xì)胞肺癌組織及其癌旁正常組織中的表達(dá)。A：dlk1基因在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)情況的瓊脂糖凝膠電泳示意圖，18s為內(nèi)參對(duì)照基因；B：dlk1基因在30例非小細(xì)胞肺癌組織與其配對(duì)癌旁正常組織表達(dá)情況的比較。Fig 1 Expression pattern of dlk1 in 30 non-small cell lung cancer(NSCLC) specimens and the paired adjacent normal lung tissues. A:Representative results of RT-PCR of dlk1 from NSCLC (T) and their adjacent non-cancerous lungs (N), where 18s was employed as internal control； B: A histogram represents the relative expression of dlk1 among 30 NSCLC specimens and their adjacent normal lung tissues.

2.2 含正確dlk1基因序列的真核表達(dá)載體的獲得 隨機(jī)挑取不同的5個(gè)菌落，小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA后，經(jīng)酶切電泳鑒定，1-3號(hào)質(zhì)粒中插入了目的基因dlk1（酶切產(chǎn)物長(zhǎng)度與PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度一致，圖2）。取這3個(gè)細(xì)菌克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定顯示，2號(hào)質(zhì)粒與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中目的序列一致，用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖 2 不同菌落小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA后經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切后電泳圖。M：DNA Lader，1-5為質(zhì)粒編號(hào)。插入的目的基因長(zhǎng)度為1 257 bp，真核表達(dá)載體pcDNA3.1長(zhǎng)度為5.5 kb。Fig 2 Electrophoretogram of 5 different plasmids digested by restriction endonuclease. M: DNA Lader, 1-5: plasmid ID. The inserted fragment of target gene dlk1 was 1 257 bp and the vector pcDNA3.1 was 5.5 kb in length.

2.3 穩(wěn)定表達(dá)外源性dlk1基因的H520細(xì)胞的獲得與篩選分別收集作為空白對(duì)照的親本H520細(xì)胞、H520-pcdb和H520-dlk1細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA及蛋白質(zhì)。分別進(jìn)行RTPCR（圖3A）及Western blot（圖3B）分析。結(jié)果顯示，H520-dlk1細(xì)胞中在RNA及蛋白水平均可檢測(cè)到外源性dlk1基因的表達(dá)，而在空白H520細(xì)胞及空載體H520-pcdb細(xì)胞中，均未檢測(cè)到dlk1，表明已經(jīng)成功篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)外源性dlk1基因的H520細(xì)胞，用于后續(xù)研究。

圖 3 外源性dlk1基因在H520細(xì)胞中的表達(dá)鑒定。A：RT-PCR檢測(cè)dlk1基因在空白H520細(xì)胞、H520-pcdb細(xì)胞及H520-dlk1細(xì)胞中的表達(dá)，M：Marker，NTC：無(wú)模板的PCR陰性對(duì)照，胎盤(pán)組織cDNA為陽(yáng)性對(duì)照，18s為內(nèi)參對(duì)照基因。B：Western Blot檢測(cè)DLK1蛋白在上述3種細(xì)胞中的表達(dá)，GAPDH為內(nèi)參對(duì)照。Fig 3 The expression of dlk1 in H520 cell was examined by both RTPCR and Western blot analysis. A: RT-PCR analysis of dlk1 expression in blank H520, H520-pcdb and H520-dlk1 cells. M: Marker, NTC: none template control, placenta cDNA was used as positive control. B:Western blot analysis of dlk1 expression.

2.4 dlk1基因過(guò)表達(dá)對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖的影響及其調(diào)控的分子機(jī)制 以CCK8方法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察穩(wěn)定表達(dá)dlk1基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響，并采用平板集落形成實(shí)驗(yàn)對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行驗(yàn)證。如圖4A所示，穩(wěn)定表達(dá)dlk1基因的H520-dlk1細(xì)胞與轉(zhuǎn)染空載體的H520-pcdb細(xì)胞及空白的H520細(xì)胞相比細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快，而空載組H520-pcdb與空白組H520細(xì)胞相比細(xì)胞生長(zhǎng)速度則無(wú)明顯差別。平板集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4B）同樣發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)dlk1基因可以促進(jìn)H520細(xì)胞的集落形成能力。同樣條件下，H520-dlk1細(xì)胞的集落形成數(shù)量與H520-pcdb組及H520空白組相比均有明顯增加，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而空載體組與空白組細(xì)胞間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖 4 穩(wěn)定表達(dá)dlk1基因?qū)?xì)胞體外增殖能力的影響。A：以CCK8繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。橫坐標(biāo)為時(shí)間（單位天），縱坐標(biāo)為CCK8在450 nm處的OD值。B：細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果及計(jì)數(shù)柱形圖（*t-test，P＜0.05）。Fig 4 dlk1 accelerates cell proliferation in vitro. A: CCK8 analysis based cell growth curve. X axis represents time in days while Y axis is the absorption of CCK8 in 450 nm. B: Clone forming assay representations and histogram of the clone counts (*t-test, P＜0.05).

2.5 dlk1基因過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期蛋白CyclinB1表達(dá)水平的影響 利用Western blot技術(shù)，對(duì)細(xì)胞中CyclinB1的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），與空載組H520-pcdb及空白組H520細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達(dá)DLK1蛋白的H520-dlk1細(xì)胞中CyclinB1的表達(dá)明顯上調(diào)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而空載組與空白組間無(wú)明顯差異。

圖 5 穩(wěn)定表達(dá)dlk1基因?qū)?xì)胞中CyclinB1表達(dá)水平的影響。柱形圖中縱坐標(biāo)為以Gapdh為內(nèi)參對(duì)照基因矯正后的CyclinB1相對(duì)表達(dá)量（*t-test，P＜0.05）。Fig 5 dlk1 induces CyclinB1 expression in H520 cells. The histogram represents the relative expression of CyclinB1 adjusted by housekeeping gene Gapdh (*t-test, P＜0.05).

3 討論

本實(shí)驗(yàn)室前期針對(duì)82例肺鱗癌患者的腫瘤及其對(duì)照組織的mRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，dlk1基因在肺癌組織中較癌旁正常組織高表達(dá)（尚未發(fā)表的資料）。本項(xiàng)研究采用另外30例非小細(xì)胞肺癌腫瘤及配對(duì)癌旁組織證實(shí)了dlk1基因確實(shí)在非小細(xì)胞肺癌中存在異常高表達(dá)。此外，本項(xiàng)研究的預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，dlk1基因在一系列非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中表達(dá)。為進(jìn)一步探討dlk1基因的分子功能，我們選擇了不表達(dá)內(nèi)源性dlk1基因的肺癌細(xì)胞系H520作為模型，進(jìn)行后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)研究。

細(xì)胞周期調(diào)控失效、細(xì)胞無(wú)限增殖是腫瘤細(xì)胞的特征之一。已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中一系列細(xì)胞周期相關(guān)蛋白出現(xiàn)異常高表達(dá)，其中包括CyclinD1[10,11]、CyclinE[12,13]、CDC25A[14]等。而細(xì)胞的分化與增殖是一組對(duì)立的關(guān)系。在生物體內(nèi)，處于終末分化狀態(tài)、行使特定功能的細(xì)胞往往不具有增殖的能力。相反，保持旺盛增殖能力的細(xì)胞均為干細(xì)胞，并不具有特定的細(xì)胞行為。dlk1參與多種細(xì)胞分化過(guò)程的調(diào)節(jié)，其功能必然與細(xì)胞的增殖有某種關(guān)系。Huang等[7]報(bào)道，過(guò)表達(dá)DLK1蛋白可以導(dǎo)致肝癌細(xì)胞系SMMC-7721增殖加快，而利用siRNA抑制內(nèi)源性dlk1基因表達(dá)可以降低細(xì)胞體外集落形成率，并抑制細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤性。Yin等[6]在對(duì)腦膠質(zhì)瘤的研究中得到了同樣的結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)dlk1基因高表達(dá)可引起CyclinD1、CDK2、E2F1等蛋白表達(dá)上調(diào)，并認(rèn)為這可能是其引起的細(xì)胞增殖加快的可能原因之一。Kim[15]與Ruiz-Hidalgo[16]等研究發(fā)現(xiàn)dlk1基因可以引起ERK蛋白磷酸化，進(jìn)而激活MAPK信號(hào)通路，并且這種激活作用存在劑量、時(shí)間依賴關(guān)系。考慮到腫瘤異質(zhì)性以及腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤的影響，dlk1基因在不同腫瘤中的作用及分子機(jī)制可能存在差別，而其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。我們利用穩(wěn)定表達(dá)dlk1基因的H520肺癌細(xì)胞模型研究dlk1基因與肺癌細(xì)胞增殖之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，穩(wěn)定表達(dá)dlk1基因可以顯著增加細(xì)胞的增殖速度，并可以增加細(xì)胞的集落形成能力（圖4）。這與文獻(xiàn)中的報(bào)道是一致的。

進(jìn)一步的Western blot結(jié)果則顯示，穩(wěn)定表達(dá)dlk1基因后，可以引起CyclinB1表達(dá)的上調(diào)（圖5）。Cyclin家族蛋白是一類細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，不同類型的Cyclin蛋白在細(xì)胞周期的不同階段特異性表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞周期的有序、正常進(jìn)行。研究表明，CyclinD在整個(gè)細(xì)胞周期中均有較高表達(dá)，其與CDK4/5結(jié)合，在細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中起到調(diào)控作用。而CyclinB在細(xì)胞進(jìn)入S期后開(kāi)始出現(xiàn)表達(dá)，其表達(dá)水平的峰值出現(xiàn)在細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期過(guò)程中。CyclinD與CyclinB1分別在細(xì)胞周期的G1/S及G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)起到調(diào)控作用。以往的報(bào)道均集中于dlk1基因高表達(dá)引起的CyclinD表達(dá)上調(diào)及細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期的增加，卻沒(méi)有對(duì)細(xì)胞周期中其他蛋白表達(dá)水平變化的相關(guān)報(bào)道。我們則發(fā)現(xiàn)dlk1基因高表達(dá)可以導(dǎo)致CyclinB1表達(dá)水平上調(diào)，提示dlk1基因可能通過(guò)作用于多個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，在多個(gè)細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)中調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖能力，這為dlk1基因引起的細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)的分子機(jī)制提供了新的線索。

在獲得上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們還應(yīng)注意到，雖然DLK1屬于表皮生長(zhǎng)因子類家族蛋白，但其與DLL1相比缺少DSL結(jié)構(gòu)域，而這個(gè)結(jié)構(gòu)域在激活下游信號(hào)通路中起著重要作用，提示DLK1蛋白可能通過(guò)其他途徑向胞內(nèi)傳遞信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。因此，準(zhǔn)確鑒定DLK1的相互作用蛋白及其參與調(diào)控的胞內(nèi)信號(hào)通路具有重要意義，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。