張 存，王一成，孫小梅，俞元明，袁秀芳，葉偉成，劉蔓雯

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021;2.浙江省湖州眾旺禽業(yè)有限公司，浙江 湖州 313014;3.桐鄉(xiāng)市烏鎮(zhèn)鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)服務(wù)中心，浙江 桐鄉(xiāng) 314501)

1990年代以來，高致病性禽流感 (avian influenza)H5N1亞型的變異毒株可以導(dǎo)致鴨和番鴨發(fā)病死亡，疫苗免疫已經(jīng)成為該病防控的主要措施之一［1］。在研究工作和畜牧生產(chǎn)上必須開展大量的鴨和番鴨等水禽禽流感抗體檢測(cè)和監(jiān)測(cè)以評(píng)價(jià)疫苗免疫效果，血凝 (HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)是最常用的方法。我國(guó)檢測(cè)高致病性禽流感HI抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法以雞紅細(xì)胞作為HI試驗(yàn)的凝集抑制指示細(xì)胞［2］，在檢測(cè)水禽血清抗體時(shí)，常常出現(xiàn)非特異性凝集現(xiàn)象，干擾檢測(cè)結(jié)果的判定［3］。因此我們開展了禽流感抗原凝集鴨和番鴨紅細(xì)胞特性的檢測(cè)、不同 (品)種鴨紅細(xì)胞與血清交叉凝集試驗(yàn)，確定了櫻桃谷鴨紅細(xì)胞代替雞紅細(xì)胞進(jìn)行HI試驗(yàn)，并和RDE處理等方法進(jìn)行了比較。

1 材料和方法

1.1 抗原和血清

高致病性禽流感 HI抗原 (批號(hào)2005061104)和陽性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)。番鴨、櫻桃谷肉鴨和麻鴨血清采集自杭州市華東家禽交易市場(chǎng)，每種4～6群，每群隨機(jī)采集8～10只。

1.2 紅細(xì)胞 (RBC)懸液的制備

采集非免疫3只成年伊莎公雞或者櫻桃谷鴨、麻鴨、番鴨血液，與等量阿氏液 (葡萄糖20.5 g·L－1，檸檬酸鈉 8 g·L－1，檸檬酸 0.55 g·L－1，氯化鈉 4.2 g·L－1，pH 值 6.1)混合后，以 PBS(0.01 mol·L－1，pH 值 7.2)洗滌 3～4次以除去血漿和白細(xì)胞，每次均以1 000 r·min－1離心 10 min，紅細(xì)胞沉淀以 PBS配置成1%的懸液［2］。

1.3 血清受體破壞酶 (RDE)處理

按文獻(xiàn)方法處理麻鴨、番鴨和櫻桃谷肉鴨血清各20份，以雞紅細(xì)胞進(jìn)行HI試驗(yàn)，并與鴨紅細(xì)胞作對(duì)比。RDE處理鴨血清的具體程序?yàn)?0.3 mL RDE(由浙江省疾病防控中心盧亦愚教授惠贈(zèng))與0.1 mL血清混合，37℃水浴過夜，56℃ 30 min滅活，再加入0.6 mL PBS使血清稀釋為1∶10。

1.4 血凝和血凝抑制試驗(yàn)方法

按照文獻(xiàn)［2］操作。結(jié)果判定:血凝被完全抑制的血清最大稀釋度為血凝抑制試驗(yàn)的終點(diǎn)，該孔稀釋度的倒數(shù)即為HI試驗(yàn)的效價(jià)。

2 結(jié)果和分析

2.1 AIV抗原對(duì)雞鴨紅細(xì)胞的凝集效價(jià)

以雞紅細(xì)胞 (CRBC)、番鴨紅細(xì)胞(mDRBC)、櫻桃谷鴨紅細(xì)胞 (yDRBC)和紹興鴨紅細(xì)胞 (sDRBC)進(jìn)行HA試驗(yàn)，結(jié)果表明，H5亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)抗原對(duì)4種家禽的紅細(xì)胞凝集效價(jià)完全一致，均為8log2(表1)。

表1 AIV H5N1抗原凝集雞鴨紅細(xì)胞效價(jià)比較

2.2 鴨血清對(duì)雞紅細(xì)胞和鴨紅細(xì)胞的凝集比較

將4個(gè)番鴨血清樣品、6個(gè)麻鴨血清樣品、5個(gè)櫻桃谷肉鴨血清樣品和2個(gè)AIV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清(雞)倍比稀釋后與紅細(xì)胞懸液等量混合，室溫保持30 min觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4只番鴨血清、6個(gè)麻鴨血清中有3個(gè)樣品與CRBC出現(xiàn)1～3孔 (2～8倍稀釋)凝集或者可疑凝集，櫻桃谷肉鴨血清未出現(xiàn)凝集CRBC的現(xiàn)象。而雞的血清可以凝集 yDRBC，即使16倍稀釋后也可出現(xiàn)凝集。番鴨、麻鴨、櫻桃谷肉鴨血清與yDRBC混合后均未見到凝集現(xiàn)象 (表2)。因此，以雞紅細(xì)胞測(cè)定番鴨、麻鴨血清或者以鴨紅細(xì)胞測(cè)定雞血清的AIV HI效價(jià)將會(huì)出現(xiàn)非特異性凝集的干擾，可以使用yDRBC代替CRBC測(cè)定番鴨、麻鴨和櫻桃谷鴨的AIV HI抗體。

此外，以yDRBC測(cè)定番鴨、麻鴨禽流感的HI效價(jià)與本種動(dòng)物紅細(xì)胞測(cè)定的效價(jià)一致，未見差別。

表2 鴨血清對(duì)雞、櫻桃谷鴨紅細(xì)胞的凝集效果

2.3 yDRBC測(cè)定鴨血清 HI抗體與 RDE處理的比較

紹興鴨、櫻桃谷鴨和番鴨血清各20個(gè)樣品經(jīng)過RDE處理后以 CRBC進(jìn)行 HI試驗(yàn)，同時(shí)以yDRBC進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果 (表3)顯示:(1)櫻桃谷鴨和番鴨血清樣品符合率 (以±1個(gè)滴度視為符合)均達(dá)到100%，紹興鴨樣品符合率為80%;(2)2種方法檢測(cè)的20個(gè)樣品平均滴度相差櫻桃谷0.2log2，番鴨0.1log2，紹興鴨差別最大為0.75 log2;(3)對(duì)于高抗體滴度的血清樣品檢測(cè)結(jié)果，2種方法差異較小，低抗體樣品稍大。此外，即使經(jīng)過 RDE處理，沉底的紅細(xì)胞 (不凝集)流動(dòng)性仍然很差，終點(diǎn)判定較為困難，而使用櫻桃谷鴨紅細(xì)胞可以容易地根據(jù)紅細(xì)胞的流動(dòng)性來判定結(jié)果。

表3 2種檢測(cè)鴨AIV 抗體血凝抑制試驗(yàn)方法比較

2.4 RDE處理和CRBC吸附對(duì)鴨血清HI檢測(cè)結(jié)果的影響

以yDRBC檢測(cè)鴨血清AIV HI抗體水平，與經(jīng)過RDE處理和CRBC吸附后的檢測(cè)結(jié)果相比，紹興鴨HI抗體平均滴度基本一致，而櫻桃谷鴨和番鴨血清分別高0.7log2和0.8log2，因此以 yDRBC進(jìn)行HI試驗(yàn)檢測(cè)鴨血清，其敏感性略高于CRBC。鴨血清即使經(jīng)過CRBC吸附處理，仍然不能完全消除其對(duì)CRBC的非特異性凝集作用。

表4 雞紅細(xì)胞吸附對(duì)鴨血清HI抗體檢測(cè)結(jié)果的影響

2.5 上市鴨群部分血清樣品H5 HI滴度分布

對(duì)市場(chǎng)采集的部分肉用鴨高致病性禽流感抗體進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果 (表5)顯示:紹興鴨公鴨、櫻桃谷肉鴨和番鴨的H5N1亞型禽流感HI抗體合格率 (≥4log2)分別為100%、98%和100%，平均滴度分別為 5.94log2、5.1log2和 6.82log2，表明禽流感疫苗免疫效果很好，上市時(shí)抗體合格率幾乎達(dá)到100%。

表5 上市肉鴨H5N1抗體檢測(cè)分布和合格率

3 小結(jié)與討論

HA和HI試驗(yàn)是我國(guó)檢測(cè)禽流感抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法，在科研、教學(xué)和生產(chǎn)上廣泛采用。禽流感病毒表面的HA蛋白可以和動(dòng)物紅細(xì)胞表面的受體結(jié)合引起紅細(xì)胞凝集，因此可以根據(jù)阻斷這種凝集紅細(xì)胞的血清稀釋度來判定血清中抗體的含量。

不同動(dòng)物的血清和紅細(xì)胞之間可能存在影響凝集的因素［3］，如雞紅細(xì)胞和鴨血清就會(huì)出現(xiàn)非特異性的凝集，相反鴨紅細(xì)胞和雞血清之間也會(huì)出現(xiàn)非特異性的凝集現(xiàn)象。因此為了保證HI試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，必須消除血清中非特異性的影響因子。RDE處理待檢血清一般可以消除異種動(dòng)物血清的非特異性凝集因子，但RDE處理方法耗時(shí)、昂貴，不適合大量檢測(cè);將血清以紅細(xì)胞吸附后進(jìn)行HI試驗(yàn)，但非特異性凝集因子消除不完全。本試驗(yàn)對(duì)麻鴨、櫻桃谷肉鴨和番鴨血清與紅細(xì)胞進(jìn)行了交叉凝集試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)同種動(dòng)物的紅細(xì)胞與血清間不存在非特異性凝集現(xiàn)象，這和張?jiān)u滸等［3－4］的研究結(jié)果一致。但在禽流感的實(shí)際監(jiān)測(cè)過程中，存在番鴨、肉鴨以及蛋鴨等不同種或品種，需要采集和使用不同 (品)種鴨的紅細(xì)胞，如果能夠使用一種紅細(xì)胞即可檢測(cè)各 (品)種鴨的 HI抗體，將增加HI方法的易用性和便利性，試驗(yàn)分別比較了櫻桃谷鴨、麻鴨、番鴨之間血清和紅細(xì)胞的交叉凝集現(xiàn)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鴨種間不存在血清和紅細(xì)胞的交叉凝集現(xiàn)象，可以使用鴨紅細(xì)胞懸液進(jìn)行鴨、番鴨血清抗體的HA和HI試驗(yàn)。

采用櫻桃谷鴨紅細(xì)胞檢測(cè)紹興鴨、櫻桃谷鴨和番鴨血清，能夠消除鴨血清非特異性凝集雞紅細(xì)胞對(duì)HI抗體檢測(cè)結(jié)果的影響，凝集圖象清晰，可以通過紅細(xì)胞的流動(dòng)性來判定結(jié)果 (即將血凝板傾斜45o角并保持5 s，不凝集的沉底紅細(xì)胞會(huì)流動(dòng))結(jié)果易于判定，減少了HI試驗(yàn)結(jié)果判定的主觀性;而以雞紅細(xì)胞檢測(cè)鴨和番鴨血清的HI抗體，即使血清經(jīng)過RDE處理、紅細(xì)胞吸附，仍然不能完全消除這種非特異性凝集作用，不凝集的紅細(xì)胞也無流動(dòng)性，在終點(diǎn)判定時(shí)比較困難，干擾結(jié)果的判定。檢測(cè)不同品種鴨和番鴨的血清抗體僅僅使用櫻桃谷肉鴨紅細(xì)胞即可，而不必制備多種鴨紅細(xì)胞，在水禽禽流感抗體檢測(cè)和監(jiān)測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

［1］甘孟侯.禽流感［M］.北京.北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002.

［2］GB/T 1836－2003高致病性禽流感診斷技術(shù) ［S］.

［3］張?jiān)u滸，唐應(yīng)華，仇旭升，薛峰，等.不同家禽紅細(xì)胞懸液對(duì)禽流感血清抗體檢測(cè)的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，2005，35(4):267－271.

［4］李金華，葉偉成，王一成，等.雛鴨禽流感母源抗體消長(zhǎng)動(dòng)態(tài)測(cè)定［J］.浙江畜牧獸醫(yī)，2008(2):1－2.