李紅梅 滑峰 趙誠 劉光振 周清華

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率均位于所有惡性腫瘤首位，危害極大。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是提高肺癌生存期的關(guān)鍵。大量研究[1]表明，端粒酶的活化是大部分腫瘤發(fā)生的前提條件，端粒酶活性表達(dá)存在于肺癌發(fā)生的早期階段，端粒酶的異?；罨c肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。以往文獻(xiàn)[2]報道的肺癌端粒酶活性檢測標(biāo)本多來源于手術(shù)切除標(biāo)本、纖支鏡活檢標(biāo)本或肺泡灌洗液等，這些方法均存在一定的局限性，有研究表明肺癌患者痰或惡性胸腔積液中端粒酶的活性高度表達(dá)，在肺癌的早期診斷中具有重要作用。本文采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增-酶聯(lián)免疫吸附實驗（TせP-PCR-ELISA）的方法分別測定了肺癌伴胸水患者和良性病變伴胸水患者的誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶的活性，探討端粒酶聯(lián)合檢測對肺癌的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 2007年1月-2008年12月確診的80例肺癌伴胸水患者，其中男性50例，女性30例，年齡49歲-76歲，平均年齡59.5歲；鱗癌39例，腺癌21例，小細(xì)胞癌15例，大細(xì)胞癌5例。肺部良性病變患者50例，均伴有胸水，其中男性32例，女性18例，年齡47歲-73歲，平均齡57.5歲；其中結(jié)核性胸膜炎25例，肺炎18例，支氣管擴(kuò)張5例，肺膿腫2例。肺癌組患者經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實并且未做過治療。肺部良性病變組選用呼吸系統(tǒng)常見疾病并排除其它部位的腫瘤的患者。

1.2 誘導(dǎo)痰標(biāo)本的采集與處理 肺癌患者及良性病變組均收集誘導(dǎo)痰。誘導(dǎo)方法[3]為：常規(guī)吸入沙丁胺醇200 μg，然后超聲霧化吸入流量為1 mL/min的3%-5%的高滲鹽溶液20 min，整個過程鼓勵患者咳嗽，收集痰液3 mL-5 mL于無菌杯中，立即用4oC無菌生理鹽水洗滌兩遍，加入等量的1 moL/L NaOH堿液，置4oC冰箱24 h堿化，取溶解痰液于4oC、3 000 r/min，離心10 min，棄上清液。沉淀重懸于PBS中，4oC、3 000 r/min，再次離心10 min，棄上清液，沉淀置于-80oC冰箱中待用。檢測時取出冷凍的標(biāo)本在冰上解凍后重懸于200 μL的端粒酶裂解液中冰浴、離心后移取上清液至EP管中待用。

1.3 胸水細(xì)胞提取液的制備 常規(guī)行胸腔穿刺術(shù)抽取新鮮胸水100 mL送檢，離心（4oC, 1 200 r/min, 10 min），棄上清，離心細(xì)胞置液氮中保存（-196oC）。檢測前用預(yù)冷的PBS緩沖液（pH7.4）漂洗細(xì)胞2次，分別離心（4oC, 1 200 r/min, 10 min），棄上清。加預(yù)冷的端粒酶裂解緩沖液，0oC 孵化30 min，離心（4oC, 12 000 r/min, 20 min），吸出上清液（含端粒酶），取少許測定蛋白濃度，將細(xì)胞提取物稀釋至3 μg/μL。

1.4 纖維支氣管鏡活組織檢查 采用Olympus CV 2260型電子纖維支氣管鏡對所有患者進(jìn)行檢查，采取活檢的肺組織，用PBS液沖洗后用液氮速凍置于-80oC冰箱保存。檢測時取冰凍活檢組織，剪碎，加入100 μL細(xì)胞裂解液充分混勻，水浴30 min，4oC、1 600 r/min離心20 min，收集上清液置于-80oC冰箱凍存?zhèn)溆?。在操作纖支鏡前常規(guī)進(jìn)行心電圖、胸片或胸部CT檢查、血常規(guī)及出、凝血時間檢查。纖維支氣管鏡未能證實的肺癌患者均通過經(jīng)皮肺穿或開胸活檢、痰中或胸水中檢測脫落細(xì)胞最終得以證實。

1.5 端粒酶活性測定 采用TRAP-ELISA法，將上述各種標(biāo)本的沉淀細(xì)胞（約1×105-1×106）置于1.5 mL離心管，150 μL裂解液抽提端粒酶。端粒酶活性和聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)：5×端粒重復(fù)擴(kuò)增反應(yīng)混合液10 μL，TaqDNA多聚酶（5 U/μL）0.4 μL，樣品提取液2 μL，蒸餾水37.6 μL。采用PCR擴(kuò)增儀，酶反應(yīng)：30oC，30 min。PCR循環(huán)擴(kuò)增：94oC，30 s；55oC，30 s，35個循環(huán)。陰性對照加2 μL裂解液；陽性對照加1 μL端粒酶質(zhì)控模板溶液。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)包被好的微量96孔板捕獲后，加人辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗二硝基苯抗體（Anti-DNP）孵育1 h后洗滌，四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色10 min。MK3酶標(biāo)儀（Dragon Lab System公司）上用雙波長法測定各孔波長450 nm吸光度（A450）、波長690 nm吸光度（A690）的值，A690為參考，用于消除孔間誤差。端粒酶活性為△A= A450-A690?！鰽大于陰性對照孔的2.0倍即判定為端粒酶陽性。敏感性=肺癌組測定指標(biāo)的陽性例數(shù)/肺癌組總例數(shù)；特異性=良性疾病組測定指標(biāo)的陰性例數(shù)/良性疾病組的總例數(shù)；準(zhǔn)確性=（真陽性數(shù)+真陰性數(shù)）/研究總例數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包，端粒酶活性定量值以Mean±SD表示，比較采用t檢驗；不同病理類型的肺癌伴胸水患者間誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶活性的比較采用方差分析；端粒酶活性陽性率比較用兩樣本率的χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

80例肺癌患者通過纖維支氣管鏡檢查確診為肺癌的有60例，胸水中檢出腫瘤細(xì)胞的12例，經(jīng)皮肺穿活檢或淋巴結(jié)活檢的有8例。肺癌伴胸水患者和肺部良性病變伴胸水患者在誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織中端粒酶活性的定量比較見表1，結(jié)果顯示肺癌伴胸水患者三種標(biāo)本中端粒酶的活性均明顯高于肺部良性病變患者（P＜0.001）。

不同病理類型的肺癌患者三種標(biāo)本中端粒酶活性的比較見表2（經(jīng)方差齊性檢驗四組不同病理類型的肺癌患者的總體方差相同），其三種標(biāo)本的端粒酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

三種標(biāo)本中端粒酶活性的檢測對肺癌的診斷敏感性、特異性和準(zhǔn)確性見表3，其中三種標(biāo)本聯(lián)合檢測敏感性的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為：三種標(biāo)本有一個以上檢測為陽性即判斷為陽性，三種標(biāo)本全為陰性即判斷為陰性。聯(lián)合檢測的敏感性與單獨(dú)檢測相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

端粒是真核生物染色體末端包含著獨(dú)特重復(fù)片段的特殊結(jié)構(gòu)，在保護(hù)染色體和染色體復(fù)制方面起著重要作用。線性染色體末端的DNA合成是不完全的，隨著每次細(xì)胞分裂，端粒片段會進(jìn)行性縮短，最終會導(dǎo)致衰老細(xì)胞的凋亡或程序性死亡。端粒長度被認(rèn)為是細(xì)胞的“有絲分裂鐘”，而端粒酶作為一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，能夠以自身RNA為模板，合成端粒末端重復(fù)（TTAGGG）n，對穩(wěn)定端粒長度從而使細(xì)胞獲得無限增殖能力和不致死性，成為永生細(xì)胞，甚至惡性轉(zhuǎn)變，發(fā)揮重要作用[4]。端粒酶是迄今為止發(fā)現(xiàn)的較為廣譜的腫瘤標(biāo)志物[5]，已成為最有希望的抗腫瘤的靶點之一[6]。端粒酶在肺癌組織中選擇性的高表達(dá)，為以端粒酶為靶點進(jìn)行肺癌的基因治療提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)[7]。90%以上癌細(xì)胞表達(dá)端粒酶活性，雖然其端粒長度很短，但由于端粒酶的激活維持了端粒長度，因而有可能獲得無限增殖，而端粒酶活性增高不存在于正常組織和體細(xì)胞[8]。

Sen等[9]分別檢測了42例可疑肺癌患者及10例良性肺病變患者的痰液、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage, BAL）和活檢（氣管鏡）標(biāo)本的端粒酶活性，結(jié)果表明，42例可疑肺癌患者中痰液、BAL、活檢標(biāo)本端粒酶陽性率分別為81.6%、68.4%、86.8%，10例良性肺病變者僅1例BAL陽性低表達(dá)，隨后被證實有大量的炎性細(xì)胞。評價分析表明端粒酶鑒別良、惡性肺癌的敏感性和特異性，在痰標(biāo)本分別為81.6%、100%，在BAL標(biāo)本為68.4%、100%，而活檢標(biāo)本為86.8%、100%。近年來，國內(nèi)外不少學(xué)者[10-12]通過對肺癌患者痰脫落細(xì)胞、纖維支氣管鏡刷檢物及胸水脫落細(xì)胞端粒酶活性的檢測，證明端粒酶在上述組織中高表達(dá)，說明端粒酶在肺癌的生成和發(fā)展方面具有重要作用。端粒酶活性的表達(dá)與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)[13,14]，隨著腫瘤分化程度由高到低，端粒酶陽性率呈升高趨勢。

表 1 肺癌伴胸水和肺部良性病變伴胸水患者誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶的活性（Mean±SD）Tab 1 The expression of telomerase activity in induced sputum, pleural effusion and fiberobronchoscopic biopsy in lung cancer patients and benign pulmonary disease patients with pleural effusion (Mean±SD)

表 2 不同病理類型肺癌伴胸水患者誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶的活性（Mean±SD）Tab 2 The expression of telomerase activity in induced sputum, pleural effusion and fiberobronchoscopic biopsy in lung cancer patients with different pathological types (Mean±SD)

表 3 誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶活性的診斷價值Tab 3 The diagnotic value of telomerase activity in induced sputum, pleural effusion and fiberobronchoscopic biopsy

本研究對80例肺癌伴胸水患者和50例肺部良性病變伴胸水患者，分別檢測其誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活檢組織中端粒酶的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺癌伴胸水患者誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織中端粒酶的活性分別為0.488±0.163、0.376±0.123和0.463±0.144；肺部良性病變伴胸水患者誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織中端粒酶的活性分別為0.091±0.110、0.075±0.009和0.088±0.108，肺癌組均明顯高于肺部良性病變組。鱗癌、腺癌、小細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌的患者間三種標(biāo)本的端粒酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明端粒酶活性檢測可作為肺癌篩選的標(biāo)志物。

本研究還發(fā)現(xiàn)，肺癌伴胸水患者誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織中端粒酶活性的陽性率分別為62.5%（50/80）、46.3%（37/80）和60.0%（48/80），亦即誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶的活性對肺癌的診斷敏感性分別為62.5%、46.3%和60.0%。準(zhǔn)確性分別為66.2%、53.8%和63.8%，誘導(dǎo)痰檢測敏感性與纖維支氣管鏡活組織檢測敏感性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，胸水檢測敏感性較前兩者低。三項聯(lián)合檢測的敏感性和準(zhǔn)確性分別為85.0%和82.3%，其中敏感性與單獨(dú)的誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織的敏感性差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

有文獻(xiàn)[15]報道誘導(dǎo)痰中端粒酶活性的檢測有助于肺部良惡性疾病的診斷和鑒別診斷。診斷敏感性約為80%；胸水中端粒酶活性的檢測對肺癌診斷的敏感性約為45%。有研究表明在纖維支氣管鏡活組織中，端粒酶活性在肺癌患者明顯高于肺炎患者和正常人。本研究聯(lián)合檢測誘導(dǎo)痰、胸水和纖維支氣管鏡活組織端粒酶的活性，對肺癌的診斷敏感性較單項檢測大大提高，由于痰、胸水和纖支鏡活檢組織標(biāo)本容易獲得，聯(lián)合檢測對肺癌伴胸水患者的早期診斷有重要意義，但因樣本量較少，尚需進(jìn)一步研究證實。