滑峰 萬海粟 梅朝蓉 鄭德杰 孫琳琳 陳軍 劉紅雨 周清華

單核苷酸多態(tài)性是新一代遺傳標記，其與人類疾病的關系是遺傳學研究的重要內(nèi)容[1-4]。細胞色素P450酶2A13（cytochrome P450 2A13, CYP2A13）是人呼吸系統(tǒng)中最常見的細胞色素P450酶，可代謝煙草中前致癌物，因此被認為與肺癌等腫瘤的發(fā)生有關[5,6]。近年有較多研究者探討了CYP2A13不同單核苷酸多態(tài)性位點與肺癌的關系，得出了有意義的結論，使得關于CYP2A13單核苷酸多態(tài)性的研究成為一個活躍的領域[7-10]，從相關核酸序列數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)可以查到大量不同研究者報道的SNP數(shù)據(jù)。我們在研究CYP2A13單核苷酸多態(tài)性與肺癌關聯(lián)性實驗中發(fā)現(xiàn)了同源序列的干擾，查閱比對了不同數(shù)據(jù)庫（dbSNP、EGPsnp、HAPMAP）中的信息，發(fā)現(xiàn)部分信息相互矛盾，于是進一步做了克隆測序，以觀察同源序列是否影響SNP研究，以期引起研究者的注意，并能正確參考應用數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 原發(fā)性肺癌266例，正常體檢人群307例，來源于天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，均為漢族人群。收集樣本人群外周靜脈血2 mL，采用Axygen外周血DNA提取試劑盒提取基因組DNA備用，檢測DNA濃度為40 μg/mL左右。

1.2 CYP2A13基因rs8192789位點（Arg257Cys）基因分型及序列比對 探針及引物由ABI公司設計合成，上游引物：GGAGGACTTCATCGCCAAGAA，下游引物：CGGATGAGAAAGGAGTCGATGA，VIC標記探針：AGCGTGCGCTGGTT，F(xiàn)AM標記探針：AGCGTGCACTGGTT。實時定量PCR反應體系為10 μL，含探針0.25 μL，mix 5 μL，H2O 2.75 μL，基因組DNA 2 μL。反應條件為：94oC預變性10 min，92oC、15 s，60oC、1 min，共40個循環(huán)。結果判斷：根據(jù)PCR曲線，如為VIC標記探針S形曲線，則基因型為CC型，如為FAM標記探針S形曲線，則基因型為TT型，如為雙重S形曲線則為CT型。檢測儀器為ABI 7500 Real Time PCR system，分析軟件為SDS V1.4。每個檢測單元均設立陰性對照及兩個以上重復樣本，選擇10%樣本復測以進行實驗質(zhì)量控制。根據(jù)ABI公司設計引物應用BLAST進行序列比對。

1.3 CYP2A13基因序列測序分析及比對 設計上游引物：CGGACATGATGCCGTCAA，下游引物：GAGGCCACGATGAAGGGAG AT（由賽百盛公司合成），PCR擴增反應體系：Taq（5 U/μL）0.2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 5 μL，模板DNA 2 μL，引物各1 μL，加滅菌蒸餾水至50 μL體系。PCR反應條件：95oC預變性7 min，95oC變性45 s，58oC退火45 s，72oC延伸50 s，72oC再延伸7 min，共30個循環(huán)。采用TA克隆試劑盒p-EASY-T1 Cloning Kit（購自TransGen Biotech），將擴增產(chǎn)物克隆于p-EASY-T1載體中，轉染至大腸桿菌感受態(tài)細胞，利用藍白斑及抗生素雙重篩選，選擇30個白斑過夜搖菌后取菌液送測序。

2 結果

2.1 rs8192789位點（Arg257Cys）基因分型結果 rs8192789位點在573例人群中只有3例為TT純合型（0.5%），其余均為CT雜合型（圖1）。復測結果完全一致，計算分型結果等位基因C 0.5，等位基因T 0.5。應用BLAST比對了引物結和區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)在CYP2A13基因3' 64 kb處有同源序列，同源性97%。

圖 1 CYP2A13基因rs8192789位點實時熒光PCR曲線Fig 1 The real time fluorescence PCR curve for the genotype of CYP2A13 rs8192789

圖 2 圖PC2 R擴PC增R擴 目增的目片的段片 段的的瓊瓊脂脂糖糖電電泳泳圖圖 （ 2692b4p7 bp）FiFgi g 2u r Ae2g a roAsgea groesl ee lgeeclt erolepchtroorpehsoisr eosfi sP oCf RP CpRro pdruocdtusc (t2s2 ,64 97b pbp)

圖 3 PCR產(chǎn)物測序圖Fig 3 Sequence of PCR products

2.2 CYP2A13基因序列分析結果 PCR擴增目的片段247 bp（圖2），60個樣本測序完全一致，有大量套峰，其中101氨基酸位點處沒有dbSNP數(shù)據(jù)庫中報道的SNP位點（圖3）。將目的片段克隆，隨機挑取30個白斑，搖菌后菌液送測序，結果示247 bp、235 bp兩個序列，經(jīng)BLAST分析分別為來源于CYP2A13、CYP2A6基因的序列（圖4A，B）。

3 討論

CYP2A13是P450 II家族最新發(fā)現(xiàn)的一個酶，被認為是人呼吸系統(tǒng)中最常見的細胞色素P450酶，也是最主要的代謝煙草中前致癌物以及黃曲霉素的P450酶[5,11-14]。關于CYP2A13多態(tài)性與肺癌的關聯(lián)研究是當前一個活躍的領域，從報道的結果看，結論一致而且OR值達到2倍以上，這表明CYP2A13多態(tài)性在肺癌遺傳研究中非常值得關注[7-10]。CYP2A13基因位于人19號染色體長臂的CYP2A-T基因簇，全長7.3 kb，包括9個外顯子、8個內(nèi)含子，與CYP2A6、CYP2A7序列具有高度同源性，編碼蛋白均為494個氨基酸。由于色素氧化酶P450是一大類參與內(nèi)源性和外源性化合物代謝的酶，因此CYP2A13與其它P450酶也起碼具有40%以上的序列同源性[15]。關于CYP2A13單核苷酸公布的數(shù)據(jù)，在dbSNP數(shù)據(jù)庫中上傳了139個SNP位點，Hapmap數(shù)據(jù)庫于2009年2月公布的最新數(shù)據(jù)報告了6個SNP位點，全部包括在dbSNP中，EGPSNP數(shù)據(jù)庫暫未收錄該基因數(shù)據(jù)。

圖 4 PCR產(chǎn)物克隆測序圖A：CYP2A13序列；B：CYP2A6序列。Fig 4 Sequence of cloned products A: CYP2A13 sequence; B: CYP2A6 sequence.

我們選擇rs8192789位點定制了Taqman探針，該位點位于257位氨基酸位點，密碼子的第一個堿基為T/C，對應氨基酸分別為色氨酸、精氨酸。該位點在dbSNP數(shù)據(jù)庫中由Hapmap上傳的數(shù)據(jù)為單一的CT雜合子，而該位點在Hapmap數(shù)據(jù)庫2009年2月公布的最新數(shù)據(jù)中已經(jīng)刪除。Wang[9]利用限制性酶切的方法研究了791例中國漢族正常人群rs8192789位點的基因型頻率，其中CC、CT、TT頻率分別為82.4%、16.4%、1.2%。我們分型的結果是單一的CT雜合子，同dbSNP數(shù)據(jù)庫中的頻率是一致的，從遺傳的角度來講，這種基因型分布實際上是不可能的。利用引物結合區(qū)域序列進行了BLAST比對，發(fā)覺引物結合序列同位于該基因簇的一段假基因有97%同源性，我們認為是該同源序列導致的。雖然Hapmap更新的數(shù)據(jù)庫刪除了rs8192789位點，但我們認為這一位點SNP是應該存在的。60例樣本人群的CYP2A13序列測序完全一致，有大量套峰集中分布，包括了dbSNP數(shù)據(jù)中的rs3826712位點，進一步將序列進行了克隆測序，結果表明為CYP2A6干擾所致，我們認為rs3826712位點可能是不存在的，另外dbSNP數(shù)據(jù)庫中也沒有發(fā)現(xiàn)rs72552266位點。

造成SNP假陽性的原因除了分型技術誤差外，另一個原因就是由于同源序列導致的干擾，這也可能是導致推斷人類SNP出現(xiàn)頻率差異的主要原因。通過對CYP2A13序列的初步分析，我們認為在dbSNP數(shù)據(jù)庫中的139個SNP位點部分是由于同源序列導致的假陽性的結果。Hapmap數(shù)據(jù)庫中包含了中國漢族人群的SNP分布，是研究SNP重點參考的數(shù)據(jù)庫[16]，但由于工作量龐大，其發(fā)布的數(shù)據(jù)可能也會有疏漏，因此我們在參考這些相關數(shù)據(jù)時要重點考慮到同源序列導致的對結果的干擾，以便正確參考應用相關數(shù)據(jù)。

致謝 天津醫(yī)科大學總醫(yī)院肺癌研究所白云、孫麗亞等對本研究給予的幫助，謹致謝意。