李 黎 莫曉燕* 陳雪玉

實(shí)驗(yàn)研究

混合5’-核苷酸的分離與檢測(cè)

李 黎 莫曉燕* 陳雪玉

以核酸酶P1酶解RNA產(chǎn)物為材料，對(duì)離子交換樹脂分離混合5’-核苷酸的工藝條件進(jìn)行研究，并通過建立的RP-HPLC檢測(cè)方法鑒定單核苷酸分離效果。結(jié)果表明，陽離子交換樹脂NH-1可使4種單核苷酸有效分離，洗脫順序依次為UMP→GMP→CMP→AMP；最佳分離條件為：色譜柱徑高比＝1∶20，RNA酶解液上樣濃度20g/L，吸附時(shí)間8h，洗脫流速0.5mL/min。確定RP-HPLC C18反相柱的色譜條件為：流動(dòng)相KH2PO4-甲醇，在30mmol/L KH2PO4（pH 5.5）以及0.5mL/min流速條件下，按照KH2PO4∶甲醇=100∶0→97∶3，15min，97∶3→95∶5，1min進(jìn)行梯度洗脫。通過外標(biāo)法對(duì)混合單核苷酸的分離效果進(jìn)行檢測(cè)，證明增加吸附時(shí)間是改善分離效果的重要因素。

5’-核苷酸；陽離子交換樹脂；反相高效液相色譜；分離和檢測(cè)

核苷酸及其衍生物是醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)和科研領(lǐng)域重要的生化試劑和原料，與國外相比，國內(nèi)核苷酸工業(yè)發(fā)展緩慢，尤其是混合核苷酸的分離純化工藝大多處于分離率差、純化效率低的狀況[1-3]。本文采用陽離子交換樹脂對(duì)核酸酶P1酶解RNA的核苷酸混合液進(jìn)行分離純化研究[4-6]，并且探討4種單核苷酸的RP-HPLC檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

核苷酸混合液（核酸酶P1酶解RNA產(chǎn)物，自制）；NH-1陽離子交換樹脂（西安藍(lán)深生物科技有限公司）；AMP、CMP、GMP、UMP標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司）；甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

DU-640紫外可見分光光度計(jì)（美國BECKMAN儀器有限公司）；125-168高效液相色譜儀（美國BECKMAN儀器有限公司）；BS-100A自動(dòng)部分收集器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；HL-2恒流泵（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樹脂的選擇與處理

根據(jù)待分離核苷酸的電荷特性，選擇強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂NH-1作為分離介質(zhì)，該樹脂具有上柱量大、分離度高的特點(diǎn)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)[7-9]。

稱取適量NH-1陽離子交換樹脂，蒸餾水浸泡2h除去雜質(zhì)顆粒；加四倍樹脂量的1mol/L NaOH溶液浸泡4h，蒸餾水水洗至中性；以四倍樹脂量的1mol/L HCl浸泡4h，蒸餾水水洗至中性；再用pH 1.5的HCl浸泡樹脂，使樹脂轉(zhuǎn)為氫型后置冰箱保存待用。

1.3.2 混合單核苷酸的分離純化及鑒定

以核酸酶P1酶解酵母RNA獲得的核苷酸混合液上樣，NH-1強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂吸附，蠕動(dòng)泵控制流速，蒸餾水洗脫，使用部分收集器收集洗脫液，每管10～14mL。將收集的洗脫液依次測(cè)定254nm吸收值（A254nm）并繪制洗脫曲線。分別考查了上樣液濃度、洗脫液流速以及樹脂吸附時(shí)間與單核苷酸洗脫曲線的關(guān)系。

1.3.2.1 上樣液濃度

分別采用5g/L和10g/L的RNA酶解液上樣，色譜柱徑高比為1∶15，在洗脫流速1mL/min的條件下繪制洗脫曲線。

1.3.2.2 洗脫液流速

以20g/L 的RNA酶解液上樣，色譜柱徑高比為1∶20，分別在洗脫流速0.5和1mL/min的條件下繪制洗脫曲線。

1.3.2.3 樹脂吸附時(shí)間

以20g/L的RNA酶解液上樣分別吸附0、3和8h，色譜柱徑高比為1∶20，在洗脫流速05mL/min的條件下繪制洗脫曲線。

1.3.2.4 單核苷酸的鑒定

取0.7mL洗脫液溶于1mL KH2PO4-NaOH緩沖液（pH 7.0）中，混勻后測(cè)定其在220～300nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的紫外吸收值，根據(jù)4種核苷酸的紫外吸收光譜特性（表1）鑒定單核苷酸種類。

表1 4種單核苷酸的紫外吸收光譜特性

1.3.3 混合單核苷酸的RP-HPLC檢測(cè)

反相色譜是迄今在高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，主要是因?yàn)樗m用于分析絕大多數(shù)的非極性物質(zhì)和很多可離子化的化合物[10-12]。本文通過優(yōu)化色譜條件建立反相高效液相色譜檢測(cè)核苷酸的方法，并運(yùn)用外標(biāo)法對(duì)混合5’-單核苷酸的分離效果進(jìn)行檢測(cè)。

首先對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化選擇，采用單一標(biāo)準(zhǔn)核苷酸分別進(jìn)樣，流動(dòng)相為pH 5.5的KH2PO4與甲醇（95∶5），進(jìn)樣濃度為0.1mg/L，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm。

1.3.3.1 鹽濃度

分別在流速1和0.5mL/min的條件下，考查了10～30mmol/L KH2PO4溶液濃度對(duì)4種標(biāo)準(zhǔn)核苷酸保留時(shí)間的影響。

1.3.3.2 流速

在流動(dòng)相為10mmol/L KH2PO4條件下，改變流速（1、0.8、0.5、0.3mL/min），檢測(cè)4種標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的保留時(shí)間。

1.3.3.3 pH

在30mmol/L KH2PO4溶液、流速0.5mL/min條件下，改變KH2PO4溶液的pH（4.5、5.5、6.5），檢測(cè)4種標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的保留時(shí)間。

1.3.3.4 梯度洗脫

在30mmol/L KH2PO4溶液、流速0.5mL/min條件下，分別采用KH2PO4∶甲醇=100∶0→95∶5，10min；KH2PO4∶甲醇=100∶0→95∶5，20min；KH2PO4∶甲醇=100∶0→97∶3，15min，97∶3→95∶5，1min不同條件梯度洗脫，考查4種標(biāo)準(zhǔn)核苷酸保留時(shí)間。

在選擇的最佳色譜條件下，以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L不同濃度的4種標(biāo)準(zhǔn)核苷酸混合液分別進(jìn)樣，根據(jù)峰面積和濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將前述陽離子交換樹脂分離的4種單核苷酸樣品進(jìn)行RP-HPLC檢測(cè)，根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算4種核苷酸的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 混合單核苷酸的分離條件

2.1.1 上樣液濃度對(duì)洗脫曲線的影響

不同濃度酶解液上樣洗脫曲線如圖1。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，NH-1強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂可將混合核苷酸分離得到4種單核苷酸，但是5g/L上樣液時(shí)第4個(gè)峰峰值偏?。辉黾訚舛戎?0g/L后4個(gè)峰均明顯，第4個(gè)峰值有所提高。對(duì)于一定量的樹脂而言，條件相同的情況下，可吸附核苷酸的質(zhì)量是一定的，所以在一定范圍內(nèi)增加上柱液濃度，有利于更多的樣品被吸附，提高分離效率。

2.1.2 流速對(duì)洗脫曲線的影響

圖1 不同上樣液濃度對(duì)混合核苷酸分離的影響

不同流速的洗脫曲線如圖2。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，洗脫流速為1mL/min時(shí)，4個(gè)峰可以基本分離，但是峰值小，并且雜峰較大；降低流速至0.5mL/min后，各個(gè)峰值增加明顯，雜峰明顯減小。在交換層析時(shí)，為了保證有效交換，兩相需要有充分的接觸時(shí)間，若接觸時(shí)間短則有可能導(dǎo)致吸附不完全，出現(xiàn)洗脫液重疊交叉，不能完全分開的問題，所以適當(dāng)降低流速有利于增加兩相的接觸時(shí)間，提高吸附效果從而改善分離效率。

圖2 不同流速對(duì)混合核苷酸分離的影響

2.1.3 吸附時(shí)間對(duì)洗脫曲線的影響

相同條件下改變吸附時(shí)間的結(jié)果見圖3。從混合核苷酸洗脫曲線可知，隨著吸附時(shí)間延長(zhǎng)，核苷酸的分離效果有所提高，吸附8h洗脫曲線中4個(gè)峰的分離效果明顯好于吸附3h和吸附0h。兩相的有效吸附是分離的重要條件之一，增加吸附時(shí)間，是保證兩相充分吸附的最直接簡(jiǎn)便的方法，可以有效改善分離效果。

2.2 單核苷酸的定性鑒定

圖3 不同吸附時(shí)間對(duì)混合核苷酸分離的影響

采用分光光度法檢測(cè)單核苷酸的種類，結(jié)果見表2。將得出的數(shù)值與表1進(jìn)行對(duì)比，鑒定出4種核苷酸的洗脫順序?yàn)閁MP、GMP、CMP、AMP，此洗脫順序符合分離原理，進(jìn)一步證實(shí)本研究的分離條件和分離方法有效。

表2 4種單核苷酸定性鑒定結(jié)果

2.3 混合單核苷酸RP-HPLC的色譜條件

2.3.1 鹽濃度對(duì)分離效果的影響

不同流速條件下改變 KH2PO4溶液濃度，檢測(cè)各標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的保留時(shí)間，結(jié)果見表3?？梢钥闯?，相同流速條件下，隨著流動(dòng)相鹽濃度的提高，4種樣品保留時(shí)間不同程度延長(zhǎng)，分離度有所提高；而同一鹽濃度時(shí)，降低流速效果更佳。例如流速為0.5mL/min時(shí)，當(dāng)KH2PO4溶液從20mmol/L 增加到30mmol/L，CMP和UMP的分離度由0.45上升至0.52，因此選定30mmol/L KH2PO4溶液為最佳鹽濃度。

表3 不同鹽濃度的單核苷酸保留時(shí)間（min）

2.3.2 流速對(duì)分離效果的影響

不同流速對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)核苷酸保留時(shí)間的影響結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，隨著流速減小，單核苷酸的分離度逐漸增加，保留時(shí)間也隨之延長(zhǎng)。當(dāng)流速為0.3mL/min時(shí)，CMP和UMP的分離度為0.31；而流速為0.5mL/min時(shí)，4種核苷酸保留時(shí)間基本分開，CMP和UMP的分離度為0.29。綜合鹽濃度考察結(jié)果，確定0.5mL/min為流動(dòng)相的最佳流速。

表4 不同流速的單核苷酸保留時(shí)間（min）

2.3.3 pH對(duì)分離效果的影響

不同KH2PO4溶液pH條件下，檢測(cè)的各標(biāo)準(zhǔn)核苷酸保留時(shí)間結(jié)果見表5。由結(jié)果可知，流動(dòng)相的pH變化對(duì)單核苷的保留時(shí)間有不同程度的影響。當(dāng)KH2PO4溶液的pH為4.5時(shí)，4種核苷酸的保留時(shí)間非常接近，幾乎無法分開，分析原因是由于核苷酸隨流動(dòng)相pH降低，其有機(jī)酸的解離性質(zhì)被抑制；pH升高至5.5時(shí)，隨著核苷酸的解離，各單核苷酸的保留時(shí)間有所增加，4種核苷酸基本分開；但是pH至6.5時(shí)，4種核苷酸的分離程度下降，CMP和UMP的分離度（0.41）＜pH 5.5的分離度（0.52）。因此，選擇pH為5.5為KH2PO4溶液的最佳色譜條件。

表5 不同pH的單核苷酸保留時(shí)間（min）

2.3.4 梯度洗脫對(duì)分離效果的影響

分析單一標(biāo)準(zhǔn)核苷酸的檢測(cè)結(jié)果可知，AMP分離效果較好，CMP、UMP和GMP可基本分離但是效果不理想，特別是CMP和UMP保留時(shí)間較近，在核苷酸混合液走樣時(shí)有重疊的可能。因此，進(jìn)一步探索不同梯度洗脫條件對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)核苷酸保留時(shí)間的影響，結(jié)果見表6。KH2PO4溶液與甲醇比例從100∶0降至95∶5的梯度洗脫，4種核苷酸保留時(shí)間有所延長(zhǎng)，GMP可以分開，但CMP與UMP保留時(shí)間仍較為接近。采用15min內(nèi)KH2PO4溶液與甲醇比例從100∶0降至97∶3，再于1min內(nèi)將二者比值降至95∶5，避免AMP保留時(shí)間過長(zhǎng)，此時(shí)CMP與UMP分離效果較好。

表6 不同梯度洗脫條件的單核苷酸保留時(shí)間（min）

最終獲得的RP-HPLC色譜條件為：流動(dòng)相30mmol/L KH2PO4（pH 5.5）-甲醇，流速0.5mL/min，梯度洗脫條件KH2PO4∶甲醇=100∶0→97∶3，15min，97∶3→95∶5，1min，檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm?；旌蠁魏塑账釞z測(cè)結(jié)果如圖4，在此條件下4種核苷酸可以有效分離。

圖4 混合單核苷酸RP-HPLC圖譜

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及核苷酸的定量測(cè)定

在選擇的最佳色譜條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5，不同吸附時(shí)間條件下分離的4種核苷酸測(cè)定結(jié)果如圖6和圖7。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，增加吸附時(shí)間，分離得到的單核苷酸濃度有不同程度的增加，進(jìn)一步說明，兩相的有效吸附是分離的重要因素，增加吸附時(shí)間是保證兩相充分吸附的最直接有效方法。

3 結(jié) 論

采用NH-1陽離子交換樹脂分離核酸酶P1酶解RNA產(chǎn)物，最佳分離條件為：RNA酶解液上樣濃度20g/L，色譜柱徑高比1∶20，吸附8h，洗脫流速0.5mL/min，可將混合核苷酸有效分離，分光光度法檢測(cè)鑒定單核苷酸的洗脫順序依次為UMP、GMP、CMP、AMP。

圖6 樣品單核苷酸RP-HPLC圖譜

圖7 不同吸附時(shí)間混合核苷酸的分離結(jié)果

建立了反相高效液相色譜檢測(cè)核苷酸的方法，得到的最佳色譜條件為：流動(dòng)相KH2PO4-甲醇，在30mmol/L KH2PO4（pH 5.5）以及0.5mL/min流速條件下，按照KH2PO4∶甲醇=100∶0→97∶3，15min，97∶3→95∶5，1min進(jìn)行梯度洗脫。通過外標(biāo)法對(duì)混合單核苷酸的分離效果進(jìn)行檢測(cè)，證明增加吸附時(shí)間是改善分離效果的重要因素。

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Q524

B

1671-8194（2010）21-0045-04

西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（710049）