趙元珍，高春芳

腹部受輻射致嚴重的急性放射性腸炎，在平、戰(zhàn)時均可發(fā)生，可導致絨毛破壞，黏膜糜爛，影響食物的消化吸收，并可導致腸道細菌易位，目前尚無有效的治療方法。本實驗探討谷氨酰胺對大鼠急性放射性損傷后腸細菌易位的影響，并探討其作用機理。

1 材料和方法

1.1 動物模型及分組 正常SD雄性大鼠30只，體重200～250 g。實驗大鼠在照射前禁食12～14 h，用0.5%戊巴比妥鈉（0.8 ml/100 g體重）腹腔麻醉，一次性用60Co放射治療儀給予全腹部照射8 Gy，然后經(jīng)常規(guī)消毒后，行右頸靜脈插管術(shù)，建成急性放射性腸炎全腸外營養(yǎng)大鼠模型，進行持續(xù)7 d的全腸外營養(yǎng)。實驗動物隨機分為三組：①正常組（n=10）為未經(jīng)腹部照射的正常大鼠，作為正常對照；②常規(guī)全腸外營養(yǎng)組（STD組，n=10）：大鼠輸入不含有谷氨酰胺的靜脈營養(yǎng)液；③谷氨酰胺組（GLN組，n=10）：大鼠輸入含3%丙氨酰-谷氨酰胺 （相當于2%谷氨酰胺）的靜脈營養(yǎng)液。后兩組靜脈營養(yǎng)液的含氮量和非蛋白熱卡均相同。

1．2 檢測指標 連續(xù)7 d全腸外營養(yǎng)后，在取材前1 h，經(jīng)頸靜脈（正常組大鼠經(jīng)陰莖背靜脈）注入5－溴脫氧尿苷（BrdU；Sigma公司產(chǎn)品），劑量為50 mg/kg體重[1]（BrdU 濃度為 5 mg/ml，雙蒸水配制，置于冰箱內(nèi)備用），1 h后，動物麻醉后，取相應(yīng)腸段，測定空、回腸組織內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA的含量。剖腹取相應(yīng)空腸和回腸，固定于10%的中性甲醛中，固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片厚5 μm。常規(guī)切片HE染色，免疫組織化學染色采用ABC法，抗－BrdU（美國Sigma公司）。常規(guī)切片光鏡下觀察腸隱窩細胞有絲分裂象并計數(shù)，免疫組化切片光鏡下觀察被BrdU標記的陽性細胞，在小腸上皮細胞中分布的位置，并用文獻[2]的方法，計數(shù)每個隱窩內(nèi)陽性細胞數(shù)，以整個細胞核染色為陽性細胞進行統(tǒng)計。每組采用4只大鼠，每只動物的小腸組織采用3張非連續(xù)切片，每張切片隨機取中間部位的8～10個隱窩，計數(shù)每個隱窩內(nèi)細胞有絲分裂象和免疫組化標記的陽性細胞數(shù)，并進行統(tǒng)計學分析。

1．3 病理學觀察 取3個組大鼠回腸取回盲部近端20 cm中部，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。光鏡下觀察回腸黏膜病理變化，用VIDS半自動圖像分析儀（Olivetti，M24 型，英國 AMS 公司生產(chǎn)），隨機全盲對每個標本測量不同部位完整的絨毛高度、隱窩深度、黏膜厚度和腸壁全層厚度。

1.4 電鏡觀察 透射電鏡的標本，先切成1 cm3大小的組織塊，固定于2.5%的戊二醛中，用Epon812包埋。透射電鏡下觀察，隨機和選擇攝片，回腸上皮細胞的照片，用VIDS半自動圖像分析系統(tǒng)測定回腸上皮細胞微絨毛的高度，并比較細胞內(nèi)線粒體的變化。

1.5 腸道內(nèi)細菌易位的檢測 在嚴格無菌的條件下，剖腹取回盲部鏈狀淋巴結(jié)2枚，剪碎后置于葡萄糖蛋白胨試管內(nèi)，37℃條件下培養(yǎng)48 h，接種于普通血平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h行細菌定性檢查，以檢出大腸桿菌或革蘭陰性桿菌作為陽性結(jié)果。

表 1 3組大鼠空、回腸DNA和蛋白質(zhì)含量（mg/5 cm，±s）

表 1 3組大鼠空、回腸DNA和蛋白質(zhì)含量（mg/5 cm，±s）

與正常對照組比較，*P<0.05；與STD組比較，#P<0.05

n 空腸 回腸蛋白質(zhì) DNA 蛋白質(zhì) DNA正常對照組 6 108.60±23.53 10.13±1.46 104.35±11.87 9.68±1.70 STD 組 6 70.25±16.39* 6.26±1.56* 66.89±13.33* 5.87±1.98*GLN 組 7 93.26±19.67# 8.98±2.79# 91.32±18.77# 8.45±2.13#

表 2 大鼠小腸隱窩細胞有絲分裂數(shù)（個/隱窩，±s）

表 2 大鼠小腸隱窩細胞有絲分裂數(shù)（個/隱窩，±s）

與正常對照組比較，*P<0.05；與STD組比較，#P<0.05

n 空腸 回腸正常對照組 6 3.16±0.89 2.56±0.38 STD 組 6 3.76±0.87 3.34±0.74 GLN 組 7 6.98±1.07*# 5.55±0.89*#

2 結(jié)果

2.1 空、回腸組織蛋白質(zhì)和DNA含量 正常對照組空、回腸蛋白質(zhì)和DNA的含量均明顯高于另兩組。谷氨酰胺組（GLN組）組空、回腸蛋白質(zhì)和DNA的含量明顯高于常規(guī)對照組（STD組），見表1。

2.2 光鏡下觀察 STD組小腸絨毛高度和隱窩深度降低，腸隱窩細胞有絲分裂象少見，GLN組絨毛高度和隱窩深度較大，隱窩細胞有絲分裂象多見；3組小腸隱窩細胞有絲分裂象計數(shù)統(tǒng)計，顯示GLN組細胞有絲分裂明顯多于其它各組，見表2。

2.3 BrdU標記細胞觀察計數(shù) 正常對照組、STD組和GLN組小腸上皮細胞內(nèi)BrdU標記的細胞呈棕黃色，底色幾乎呈無色，陽性細胞很容易辨認，陰性對照片均為陰性。三個組BrdU陽性細胞均位于空、回腸黏膜層的腸腺內(nèi)，主要為腸腺基底部的上皮細胞,胞核呈棕黃色中度陽性反應(yīng)，絨毛上皮細胞內(nèi)為陰性，觀察BrdU的陽性細胞的分布，發(fā)現(xiàn)GLN組的小腸上皮細胞內(nèi)的陽性細胞數(shù)多于STD組，統(tǒng)計分析表明GLN組小腸BrdU陽性細胞數(shù)多于STD組（P<0.05），而GLN組和正常對照組兩者無顯著性差異（P>0.05），見表 3。

表3 小腸BrdU陽性細胞數(shù)（個/隱窩，±s）

表3 小腸BrdU陽性細胞數(shù)（個/隱窩，±s）

與STD組比較，*P<0.05

n 空腸 回腸正常對照組 6 11.17±4.56 10.47±3.98 STD 組 6 7.76±2.23 6.53±2.07 GLN 組 7 12.53±3.68* 11.67±3.97*

2.4 回腸的形態(tài)學觀察 肉眼觀察：STD組回腸壁水腫明顯，黏膜出血點多且密集，伴有程度不等的糜爛，而GLN組小腸壁水腫較輕，黏膜出血點少。光鏡下觀察：STD組小腸絨毛局部壞死脫落形成糜爛（8/10例），尤以回腸為甚（9/10例），脫落的上皮細胞局部形成“偽膜”樣結(jié)構(gòu)，絨毛高度和隱窩深度降低，GLN組絨毛完整（8/10例），絨毛高度和隱窩深度較大。經(jīng)半自動圖像分析作定量測定，GLN組回腸絨毛高度、隱窩深度、黏膜及全層壁厚度均顯著大于STD組，見表4。

表 4 回腸的形態(tài)學參數(shù)測量結(jié)果（μm，±s）

表 4 回腸的形態(tài)學參數(shù)測量結(jié)果（μm，±s）

與STD組比較，#P<0.001

組別 絨毛高度 隱窩深度 黏膜厚度 全層厚度正常組 275.28±12.20 186.30±13.21 465.72±15.35 632.70±17.83 STD 組 258.28±12.69 184.98±13.07 457.96±15.18 604.32±15.39 GLN 組 313.50±11.65#199.74±14.56#519.36±16.89#671.18±17.82#

2.5 小腸電鏡觀察和測量 透射電鏡下可見GLN組小腸上皮細胞微絨毛高度為（966.47±82.36）nm，明顯高于STD組的（880.54±176.47）nm。觀察上皮吸收細胞內(nèi)細胞器的變化，發(fā)現(xiàn)GLN組細胞內(nèi)線粒體稍有腫脹，但嵴排列整齊，而STD組細胞內(nèi)線粒體明顯腫脹，甚至嵴斷裂。

2.6 腸道內(nèi)細菌易位率 GLN組腸系膜淋巴結(jié)培養(yǎng)細菌易位率為40%（4/10），STD組腸系膜淋巴結(jié)培養(yǎng)細菌移位率為 80%（8/10），GLN組顯著低于STD 組（P<0.05）。

3 討論

腹部受輻射損傷導致急性放射性腸炎，致使絨毛破壞，黏膜糜爛，腸黏膜屏障破壞，影響食物的消化吸收，腸道內(nèi)細菌發(fā)生易位，而致毒血癥，病死率較高。對急性放射性腸炎缺乏有效的治療措施，常采用全腸外營養(yǎng)（TPN）支持治療，使腸道休息待其自然恢復，但長期使用常規(guī)全腸外營養(yǎng)后，可導致胃腸道黏膜萎縮，吸收功能受損，腸道內(nèi)細菌易位增加，血液及組織中GLN含量及小腸對GLN的攝取下降，從而使放射性腸炎的病死率并沒有得到顯著降低[3]。GLN是小腸黏膜等生長活躍上皮細胞合成嘌呤和嘧啶的供氮體，是其生長、增殖、分化不可缺少的能源物質(zhì)，對胃腸道黏膜損傷的修復起重要作用。筆者早先已注意到GLN的利用與急性放射性腸炎腸黏膜損傷的修復密切相關(guān)[4]。

小腸上皮細胞是對放射性損傷敏感性很高、再生能力很強的組織細胞，受輻射損傷的小腸上皮細胞常由腸腺上皮的未分化細胞增生來補充絨毛的上皮細胞，以逐漸恢復絨毛結(jié)構(gòu)和功能的完整性。GLN是胃腸道黏膜細胞的重要的呼吸能源，是核酸和蛋白質(zhì)合成的供氮體。在應(yīng)激狀態(tài)下，腸上皮細胞的增殖分化更為活躍，在施行TPN時，提供外源性GLN對保證輻射損傷腸上皮細胞DNA和蛋白質(zhì)更多地合成至關(guān)重要[5]，本文結(jié)果顯示，GLN組小腸的各項指標均優(yōu)于STD組。

利用BrdU標記S期細胞的免疫細胞化學技術(shù)，具有簡便、重復性好和無放射性等優(yōu)點。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常組和實驗組小腸黏膜內(nèi)BrdU陽性細胞均位于腸腺上皮細胞內(nèi)，因為這些細胞是絨毛上皮細胞更新的來源。正常組小腸上皮細胞BrdU陽性細胞位于腸腺內(nèi)，說明正常小腸上皮細胞增殖的活躍性，對小腸腸腺內(nèi)BrdU陽性細胞的數(shù)目進行計數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GLN組BrdU陽性細胞數(shù)明顯多于STD組，該結(jié)果表明了GLN二肽可促使急性放射性腸炎大鼠損傷小腸上皮細胞DNA的合成，促使急性放射性腸炎大鼠小腸上皮細胞的分裂增殖。

筆者還采用了透射電鏡的觀察，結(jié)果顯示，STD組小腸上皮細胞微絨毛降低和線粒體的結(jié)構(gòu)破壞嚴重，而GLN組小腸上皮細胞微絨毛明顯增高，線粒體破壞較輕，提示GLN可以保護上皮細胞超微結(jié)構(gòu)的完整性。此時微絨毛變化需要線粒體提供的能量，則由GLN提供。而STD組超微結(jié)構(gòu)破壞嚴重，可能與射線的損傷所致和常規(guī)TPN不能提供小腸上皮細胞足夠的能量有關(guān)。

本研究應(yīng)用腸系膜淋巴結(jié)細菌培養(yǎng)，結(jié)果提示STD組腸細菌易位率明顯高于GLN組，提示GLN減少腸腸細菌易位機制可能與補充外源性GLN，促進小腸上皮合成DNA和蛋白質(zhì)，促使受損小腸上皮細胞的修復，保持小腸組織結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)[4]。小腸壁結(jié)構(gòu)的完整，才能有效地阻止或減少腸道內(nèi)細菌的移位。同時也可能與GLN能降低全腸外營養(yǎng)所致的腸黏膜通透性增高有關(guān)[5]。

本文結(jié)果表明，附加丙氨酰-谷氨酰胺二肽的TPN具有較強的維護胃腸道黏膜抗輻射性損傷的作用，能更好地保護腸屏障功能和防止腸細菌移位的發(fā)生。

[1]Tanaka Y,Mak KM,Lieber CS.Immunohistochemical detection of proliferating lipocytes in regenerating rat liver.J Pathol,1990,160（2）:129.

[2]Weisgerber WM,Boeingg H,Nernitz R,et al.Proliferation cell nuclear antigen（clon 19A2） correlates with 5-bromo-2-deoxyuridine labelling in human colonic epithelium.Gut,1993,34（4）:1587.

[3]Wang JY,Zhang H,Song WL.Epidermal growth factor regulates instestinal glutamine uptake during total parenteral nutrition.Clin Nutr,1996,15（1）:21.

[4]趙元珍，高春芳.谷氨酰胺全腸外營養(yǎng)對急性放射性腸炎大鼠消化道營養(yǎng)作用的研究.中華放射醫(yī)學與防護雜志，2004，24（5）：428.

[5]夏國偉，史海安，周亞魁.表皮生長因子、谷氨酰胺強化的全腸外營養(yǎng)對腸屏障功能和腸細菌移位的影響.上海醫(yī)科大學學報，2000，27（5）:443.