馮玉奎，張立營，孫 宇，孫英姿

蓖麻毒素（ricin toxin，RT）是一種從蓖麻種子中提取的植物糖蛋白，蓖麻毒素具有很強(qiáng)的毒性作用，對成人的平均致死量為1.5 μg。蓖麻種植廣泛，蓖麻籽中蓖麻毒素含量高且易于提取，國外已有報(bào)道恐怖分子用蓖麻毒素作為恐怖襲擊的手段。因此，無論是從國際生物武器核查角度，還是從防護(hù)目的，開展對蓖麻毒素的檢測研究都具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義[1-3]。

美國西北大學(xué)Mirkin領(lǐng)導(dǎo)的課題組于2003年首次報(bào)道了生物條形碼檢測技術(shù) （bio-bar codes assay，BCA）[4]。生物條形碼檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)有：①檢測靈敏度高，比常規(guī)的ELISA方法高出六個數(shù)量級（100萬倍）；②操作程序簡單；③針對不同的目標(biāo)蛋白設(shè)計(jì)不同長度和序列的條形碼DNA，可分析復(fù)雜樣本中的多個目標(biāo)蛋白；④具有較高的特異性，只要使用高特異的抗目標(biāo)檢物的單克隆抗體就能保證檢測系統(tǒng)的高特異性；⑤檢測范圍廣，只要被檢物具有單抗和多抗，就可對其進(jìn)行檢測，這使得它在檢測一些不適宜用PCR技術(shù)檢測的微量物質(zhì)方面具有很大的優(yōu)勢[5-10]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用蓖麻毒素多抗和單抗建立了蓖麻毒素的生物條形碼檢測體系，旨為發(fā)展高靈敏度的蓖麻毒素檢測試劑盒鑒定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 蓖麻毒素、蓖麻毒素多抗、單抗由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所贈送，膠體金購自Sigma公司，銀染試劑購自sigma公司，磁性微球購自invitrogen公司，檢測使用的玻片購自TEL公司。1.2 NP探針的制備及鑒定

1.2.1 DNA合成 按文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì)合成下列寡核苷酸鏈，由上海生工公司合成?；パa(bǔ) probe NP鏈：5'-TACGAGTTGAGACCGTTAA GACGAGGCAATCATGCAATCCTGAATGCGA10-（CH2）6-SH-3'；條形碼DNA鏈：5'-CGCATTCAGGATTGCATGATT GCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTA-3'；

捕獲 DNA 鏈：5'-HS-（CH2）6-A10-TACGAGTTGAGA CCGTTAAGACGA-3'；NP標(biāo)簽鏈：5'-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCG A10-（CH2）6-SH-3'。

1.2.2 多抗標(biāo)記膠體金 分別取1 ml的膠體金和100 μg的蓖麻毒素多抗，用0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)pH至9.0。在攪拌下將膠體金和抗體混合，10 min后再加入5%BSA，使其最終濃度為1%。

1.2.3 膠體金標(biāo)記蛋白的純化 膠體金標(biāo)記蛋白先低速離心20 min，棄凝聚的金膠粒。然后13 000×g離心1 h。去除上清，沉淀物用0.01 mol/L，pH7.6 PBS混懸至原量。平衡過夜后，同上重復(fù)離心2次。最后用含 1%BSA的 PBS（含 0.02%NaN3）將沉淀物重懸為原體積的1/10，4℃保存。

1.2.4 互補(bǔ)probe NP鏈修飾膠體金 將互補(bǔ)probe NP鏈（終濃度為2 μmol/L）加入多抗修飾的膠體金中，靜置 40 h，再以 PBS調(diào)整 pH至 7.0，增強(qiáng) NaCl濃度至 0.1 mol/L，10 000×g離心 10 min得到含寡核苷酸的膠體金。

1.2.5 barcode DNA與互補(bǔ) probe NP鏈雜交 將barcode DNA（終濃度為 2 μmol/L）加入上面經(jīng)修飾的膠體金中，室溫雜交4 h，10 000×g離心，得到NP探針。

1.3 MMP探針的制備及鑒定 MMP探針的制備包括磁性微球的激活和單抗的標(biāo)記，具體過程參考其產(chǎn)品說明書。

1.4 檢測探針的制備 將NP標(biāo)簽鏈 （終濃度為2 μmol/L）加入膠體金中，靜置 40 h，再用 PBS 調(diào)整pH 至 7.0，增強(qiáng) NaCl濃度至 0.1 mol/L，10 000×g 離心10 min得到含寡核苷酸的膠體金，即為檢測探針。

1.5 生物條形碼檢測過程

1.5.1 三明治結(jié)構(gòu)的形成 將50 μl MMP探針（5 mg/ml）加入10 μl已知濃度的蓖麻毒素溶液中，37℃下劇烈震蕩1 h。加上磁場固定MMP探針，用PBS溶液反復(fù)沖洗，除去未連結(jié)的蓖麻毒素及其它不相關(guān)的蛋白。加入NP探針50μl，劇烈震蕩30 min，形成三明治結(jié)構(gòu)。接著加上磁場，用磁鐵固定MMPs探針，用100 μl PBS緩沖液反復(fù)沖洗4次，除去未連接的NP探針。

1.5.2 條形碼DNA的獲取 形成三明治結(jié)構(gòu)后，接著加上磁場，再用磁鐵固定MMPs探針（三明治結(jié)構(gòu)）的同時(shí)，用100 μl PBS緩沖液反復(fù)沖洗4次，除去未連接的NP探針。加入50 μl超純水到三明治結(jié)構(gòu)中，60℃劇烈震蕩30 min，使條形碼DNA去雜交。三明治復(fù)合物被磁性分離，收集上清液，內(nèi)含條形碼DNA，用于定性定量檢測。

1.5.3 條形碼DNA的常規(guī)PCR檢測 將獲得的條形碼DNA進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%的凝膠電泳，EB染色觀察結(jié)果。

1.5.4 條形碼DNA的芯片檢測 取10 μl條形碼DNA 與 85 μl 0.6 mol/L PBS 和 5 μl檢測探針混合，加到玻片的捕獲DNA鏈處，42℃反應(yīng)2 h，0.01 mol/L的PBS洗脫，接著將銀染液A液1 ml和B液1 ml混勻，加在芯片的捕獲DNA鏈處，靜置10 min，平板掃描儀記錄結(jié)果。

圖 1 膠體金-多抗復(fù)合物的TEM結(jié)果（×75 000）

2 結(jié)果

2.1 膠體金-多抗復(fù)合物的透射電鏡（TEM）和UV－vis鑒定 用支持膜的鎳網(wǎng)蘸取膠體金-多抗復(fù)合物，滴加磷鎢酸復(fù)染處理，直接在透射電鏡下觀察，膠體金顆粒周圍有明顯的灰黑色暈環(huán)（圖1），表明顆粒表面吸附有多抗蛋白。

納米金-BTV多抗以0.3 mol/L NaCl，10 mmol/L PBS為空白對照，掃描范圍為400～700 nm，以5 nm為掃描精度。最大吸收峰在530 nm處，最大吸光度為1.126。

2.2 NP探針的TEM鑒定和UV－vis鑒定 用支持膜的鎳網(wǎng)蘸取NP探針，滴加磷鎢酸復(fù)染處理，直接在TEM放大觀察，膠體金顆粒周圍有明顯的灰黑色暈環(huán)（圖2），表明顆粒表面吸附有多抗蛋白。

圖 2 NP探針的透射電鏡結(jié)果（×75 000）

NP 探針以 0.3 mol/L NaCl，10 mmol/L PBS 為空白對照，掃描范圍為400～700 nm，以5 nm為掃描精度。最大吸收峰在530 nm處，最大吸光度為0.968。

2.3 MMP探針鑒定結(jié)果 分光光度計(jì)檢測其標(biāo)記前后的OD值，利用下面公式檢測標(biāo)記效率：[(A280pre-coupling solution×D)-(A280post-coupling solution)×D)] ×100%/(A280pre-coupling solution×D)=0.603-0.12/0.603=0.784=78%≥60%，符合要求。

2.4 銀染時(shí)間的優(yōu)化 銀染時(shí)間過短過長都不利于結(jié)果的觀察，筆者對染色時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。分別在染色后 5、6、7、8、9 和 10 min 用蒸餾水終止反應(yīng)，進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示反應(yīng)后0~8.5 min為檢測點(diǎn)灰度明顯增加階段，8 min后檢測點(diǎn)灰度增加緩慢，而背景迅速加深（圖3），因此染色時(shí)間8 min時(shí)具有較好信噪比。

圖 3 染色時(shí)間對結(jié)果的影響

2.5 Cut-off值的確定 計(jì)算20個陰性結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以平均值加上3倍的標(biāo)準(zhǔn)差作為本實(shí)驗(yàn)中判定陽性樣本的Cut-off值。如果待測樣本的灰度值大于Cut-off值，則判為陽性，反之為陰性。經(jīng)計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)的Cut-off值為110。

2.6 條形碼DNA的檢測

2.6.1 條形碼DNA的PCR檢測結(jié)果 去雜交獲得的條形碼DNA通過常規(guī)的PCR進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見圖4。

M：標(biāo)志物；1～11蓖麻毒素的濃度依次為10、1 ng/ml，100、10 和 1 pg/ml，100、10、1 fg/ml，100 ag/ml，0 μg/ml圖 4 條形碼DNA的PCR檢測結(jié)果

PCR鑒定結(jié)果顯示檢測靈敏度可達(dá)1 fg/ml，約是常規(guī)ELISA的106倍。

2.6.2 條形碼DNA芯片檢測結(jié)果 去雜交獲得的條形碼DNA通過芯片進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見圖5。

1～11 蓖麻毒素的濃度依次為 10、1 ng/ml，100、10 和 1 pg/ml，100、10 和 1 fg/ml，100 ag/ml，0 μg/ml圖 5 條形碼DNA芯片檢測結(jié)果

利用ARRAY vision軟件對各點(diǎn)的灰度值定量， 依次為 330.5、317.4、313.1、280.6、243.6、199.6、157.2、128.6、115.9、95.1、89.6；芯片鑒定結(jié)果顯示檢測靈敏度可達(dá)1 fg/ml，約是常規(guī)ELISA的106倍。

3 討論

現(xiàn)階段根據(jù)蓖麻毒素具有的理化特性、生化特性和免疫原性發(fā)展出多種檢測法，其中以免疫檢測法為主。免疫檢測法多是依賴于抗原抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法，包括多克隆和（或）單克隆抗體為基礎(chǔ)的放射免疫法或酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫層析試驗(yàn)和電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，其中ELISA法是國際規(guī)定的檢測蓖麻毒素的金標(biāo)準(zhǔn)。檢測靈敏度最高只能達(dá)到1 ng，存在著靈敏度不高等問題，已經(jīng)不能滿足檢驗(yàn)對靈敏度的要求[11-16]。

盡管對于核酸的超靈敏檢測已成為常規(guī)手段，但對于蛋白質(zhì)仍存在困難。一個主要的原因是缺乏像PCR那樣的直接擴(kuò)增技術(shù)。Mirkin發(fā)明的生物條形碼技術(shù)的突出特點(diǎn)是具有極高的敏感度，本實(shí)驗(yàn)利用生物條形碼檢測技術(shù)對蓖麻毒素進(jìn)行了初步檢測，檢測結(jié)果顯示檢測靈敏度可達(dá)1 fg/ml，為現(xiàn)行任何一種免疫定量方法所不及[5]。本研究為制備高靈敏度的蓖麻毒素生物條形碼檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

生物條形碼檢測技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是具有極高的檢測靈敏度，這使得它在一些不能建立核酸檢測體系的微量物質(zhì)檢測，如蛋白、肽、氨基酸、激素、類固醇、細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)記物、生物戰(zhàn)劑、毒素等物質(zhì)的檢測中有著廣泛的應(yīng)用前景[17-21]。

[1]Szinicz L.History of chemical and biological warfare agents.Toxicology,2005,214(3):167-181.

[2]Olsens S.The history of ricin,abrin and related toxins.Toxicon,2004,44(4):361-370.

[3]王景林.蓖麻毒素生物恐怖及其醫(yī)學(xué)防護(hù).科技導(dǎo)報(bào)，2003，7：35-37.

[4]Nam JM,Thaxton CS,Mirkin CA.Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins.Science,2003,301(5641):1884-1886.

[5]Georganopoulou DG,Chang L,Nam JM,et al.Nanoparticle-based detection in cerebral spinal fluid of a soluble pathogenic biomarker for Alzheimer's disease.Proc Natl Acad Sci,2005,102(7):2273-2276.

[6]Bao YP,Wei TF,Lefebvre PA.Detection of protein analytes via nanoparticle-based bio-bar code technology.Anal Chem,2006,78(6):2055-2059.

[7]Taton TA,Mirkin CA,Letsinger RL.Scanometric DNA array detection with nanoparticle probes.Science,2000,289(5485):1757-1760.

[8]Nam JM,Park SJ,Mirkin CA.Bio-bar codes based on oligonucleotide-modified nanoparticles.Am Chem Soc,2002,124:3820-3821.

[9]Nam JM,Stoeva SI,Mirkin CA.Bio-bar-code-based DNA detection with PCR-like sensitivity.Am Chem Soc,2004,126:5932-5933.

[10]Thaxton CS,Hill HD,Georganopoulou DG.A biol-bar-code assay based upon dithiothreitol-induced oligonucleotide release.Anal Chem,2005,77:8174-8178.

[11]Feltis BN,Sexton BA,Glenn FL,et al.A hand-held surface plasmon resonance biosensor for the detection of ricin and other biological agents.Biosens Bioelectron,2008,23(7):1131-1136.

[12]Haes AJ,Giordano BC,Collins GE.Aptamer-based detection and quantitative analysis of ricin using affinity probe capillary electrophoresis.Anal Chem,2006,78(11):3758-3764.

[13]Kirby R,Cho EJ,Gehrke B,et al.Aptamer-based sensor arrays for the detection and quantitation of proteins.Anal Chem,2004,76(14):4066-4075.

[14]Ligler FS,Taitt CR,Shriver-Lake LC,et al.Array biosensor for detection of toxins.Anal Bioanal Chem,2003,377(3):469-477.

[15]Lubelli C,Chatgilialoglu A,Bolognesi A,et al.Detection of ricin and other ribosome-inactivating proteins by an immunopolymerase chain reaction assay.Anal Biochem,2006,355(1):102-109.

[16]Brzezinski JL,Craft DL.Evaluation of an in vitro bioassay for the detection of purified ricin and castor bean in beverages and liquid food matrices.J Food Prot,2007,70(10):2377-2382.

[17]Stoeva SI,Lee JS,Smith JE,et al.Multiplexed detection of protein cancer markers with biobarcoded nanoparticle probes.Am Chem Soc,2006,128(26):8378-8379.

[18]Park SJ,Taton TA,Mirkin CA.Array-based electrical detection of DNA with nanoparticle probes.Science,2002,295:1503-1506.

[19]King AG.Bio-bar-codes speed DNA detection.Journal of Chemical Education,2004,81(10):1388.

[20]Thaxton CS,Georganopoulou DG,Mirkin CA.Gold nanoparticle probes for the detection of nucleic acid targets.Clinica Chimica Acta,2006,363:120-126.

[21]Azzazy HM,Mansour MM,Kazmierczak SC.Nanodiagnostics:a new frontier for clinical laboratory medicine.Clinical Chemistry,2006,52(7):1238-1246.