唐麗琴，張善堂，劉 圣，石允卉（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院藥劑科，合肥市 230001）

HPLC法測定不同來源甘草中甘草酸的含量Δ

唐麗琴＊，張善堂，劉 圣，石允卉（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院藥劑科，合肥市 230001）

目的：建立以高效液相色譜法測定甘草中有效成分甘草酸含量的方法，并測定不同產(chǎn)地和基原甘草藥材中甘草酸的含量。方法：色譜柱為Hypersil-C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇-0.2 mol·L-1醋酸銨溶液-冰醋酸-三乙胺（64∶36∶1.5∶0.02），流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為252 nm，柱溫為30℃。結(jié)果：甘草酸檢測濃度在0.041 6～0.208 0 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系（r＝0.999 9）；平均回收率為101.3%，RSD＝1.22%（n＝9）。結(jié)論：不同來源甘草藥材中甘草酸的含量差異較大，野生甘草中甘草酸的含量高于家種。

甘草；甘草酸；高效液相色譜法；含量；來源

Δ安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（090413106）

＊副主任藥師，博士。研究方向：臨床藥學(xué)、藥理學(xué)。電話：0551-2283378-809。E-mail：tulcyl@vip.sina.com

甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、脹果甘草G.inflateBat.或光果甘草G.gliabraL.的干燥根及根莖，具補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥之功效[1]。甘草酸是其最重要的活性成分之一[2～4]，具有抗炎、抗?jié)?、抗肝毒素以及抗癌等藥理作用[5，6]。但商品甘草的產(chǎn)地、基原等來源復(fù)雜，其有效成分甘草酸的含量也存在很大差異，這給醫(yī)院臨床用藥造成一定影響。目前，國內(nèi)對不同來源甘草飲片有效成分的系統(tǒng)研究較少，為此本研究以甘草酸為檢測指標(biāo)，采用高效液相色譜（HPLC）法對不同產(chǎn)地不同基原的甘草進(jìn)行初步分析研究，以期為醫(yī)院的甘草飲片采購提供選擇依據(jù)，從而為臨床提供更佳的藥材。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-6A型HPLC儀，包括SPD-6AV紫外-可見檢測器、HS色譜數(shù)據(jù)工作站（日本島津公司）；ZG-1型打粉機(jī)（上海淀元實(shí)業(yè)有限公司）；BT124S型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；JK-DY500型醫(yī)用數(shù)控超聲清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）。

1.2 試藥

甘草酸單銨鹽對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110731-200614）；甲醇為色譜純，冰醋酸、醋酸銨、三乙胺為分析純，水為重蒸餾水；甘草藥材均為從當(dāng)?shù)刭徺I的市售藥材，并經(jīng)安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院劉守金教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Hypersil-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-0.2 mol·L-1醋酸銨溶液-冰醋酸-三乙胺（64∶36∶1.5∶0.02）；檢測波長：252 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。理論板數(shù)按甘草酸峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.甘草藥材；1.甘草酸單銨鹽Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.G.uralensis；1.monoammonium glycyrrhizinate

2.2 對照品溶液的制備

稱取甘草酸單銨鹽對照品約10 mg，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1.06 mg·mL-1的甘草酸單銨鹽溶液，折合甘草酸為1.04 mg·mL-1，作為對照品貯備液。再精密量取對照品貯備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得到含甘草酸分別為 0.041 6、0.083 2、0.124 8、0.166 4、0.208 0 mg·mL-1的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取甘草藥材粉末約0.2 g，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入流動相適量，超聲提取45 min，靜置，用流動相定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下各對照品溶液20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定。以峰面積積分值（A）對對照品濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A＝9.0×106C＋2 072.7（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，甘草酸檢測濃度在0.041 6～0.208 0 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取濃度為0.124 8 mg·mL-1的對照品溶液20 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果，RSD＝0.52%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取同一供試品溶液20 μL，分別在0、1、2、3、4、5、24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，RSD＝1.07%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一甘草樣品粗粉約0.2 g，平行6份，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取20 μL，按上述色譜條件測定并計(jì)算甘草酸含量。結(jié)果，RSD＝1.11%，表明方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的甘草樣品9份，每份約0.1 g，精密稱定，加入相應(yīng)量的對照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.9 最低檢測限測定

將對照品溶液稀釋測定，測得信噪比為3∶1時(shí)，甘草酸的最低檢測濃度為0.083 2 μg·mL-1。

2.10 樣品含量測定

取10個(gè)不同產(chǎn)地和基原的甘草藥材各0.2 g，精密稱定，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按上述方法測定甘草酸含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 流動相的選擇

對于甘草酸的含量測定，2005年版《中國藥典》采用的流動相為甲醇-0.2 mol·L-1醋酸銨-冰乙酸（67∶33∶1）[1]，但預(yù)試驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)甘草酸單銨鹽的保留時(shí)間太短且峰形不好。經(jīng)過多次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.2 mol·L-1醋酸銨-冰乙酸-三乙胺（64∶36∶1.5∶0.02）為流動相時(shí)，樣品分離度、對稱性及峰形均較好，且保留時(shí)間適中，故最終確定本試驗(yàn)的流動相為甲醇-0.2 mol·L-1醋酸銨-冰乙酸-三乙胺（64∶36∶1.5∶0.02）。

表2 10批甘草樣品的含量測定結(jié)果Tab 2 Content determination of glycyrrhizic acid in 10 batches of samples

3.2 提取溶劑的考察

本研究對提取溶劑（50%甲醇、甲醇、流動相）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明用流動相作提取溶劑效率最高，故最終確定用流動相作提取溶劑。

3.3 提取時(shí)間的考察

本研究考察了超聲提取的時(shí)間（20、30、45、60 min），結(jié)果表明提取45 min后，提取時(shí)間延長并不能顯著提高提取效率，故選擇提取時(shí)間為45 min。

3.4 冷浸時(shí)間的考察

本研究考察了冷浸時(shí)間（0、10 h）對提取效率的影響，結(jié)果表明冷浸對提取效率影響不大，故選擇不用冷浸。

3.5 小結(jié)

研究顯示，不同來源的甘草藥材中有效成分甘草酸的含量有較大差異，相差最大的近4倍，其中野生甘草中甘草酸的含量較家種甘草中甘草酸的含量高，編號為8、9、10的3種不同產(chǎn)地的家種烏拉爾甘草的含量低于2%，未達(dá)到2005年版《中國藥典》的最低標(biāo)準(zhǔn)。可見，不同來源的甘草藥材其內(nèi)在質(zhì)量存在較大差異，醫(yī)院在采購藥材時(shí)應(yīng)加以注意。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：59.

[2]慕桂娟.甘草化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].包頭醫(yī)學(xué)，2005，29（2）：25.

[3]田慶來，官月平，張 波，等.甘草有效成分的藥理作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18（5）：343.

[5]潘英偉，陳衛(wèi)平，奚麗君.甘草減毒作用的應(yīng)用與機(jī)理分析[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（6）：428.

[6]徐淑英，張玉臣.復(fù)方甘草酸苷治療戊型病毒性肝炎療效觀察[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29（9）：715.

Content Determination of Glycyrrhizic Acid inGlycyrrhiza uralensisfrom Different Sources by HPLC

TANG Li-qin，ZHANG Shan-tang，LIU Sheng，SHI Yun-hui（Dept.of Pharmacy，The Affiliated Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University，Hefei 230001，China）

OBJECTIVE：To establish the HPLC method for the content determination of glycyrrhizic acid inGlycyrrhiza uralensisfrom different sources.METHODS：The separation was performed on Hypersil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）column with mobile phase consisted of methanol-0.2 mol·L-1ammonium acetate-glacial acetic acid-triethylamine（64 ∶36 ∶1.5 ∶0.02）with the flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 252 nm and column temperature was 30℃.RESULTS：The linear range of glycyrrhizic acid was 0.041 6～0.208 0 mg·mL-1（r＝0.999 9）with an average recovery of 101.3%（RSD＝1.22%，n＝9）.CONCLUSION：The content of glycyrrhizic acid is variant in different origin and sources.The content of glycyrrhizic acid in wildG.uralensisis higher than that of domestic species.

Glycyrrhiza uralensis；Glycyrrhizic acid；HPLC；Content；Source

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2010）39-3700-02

2009-10-10

2009-11-06）