王茂芊 ，吳則東 ，陳 麗 ，王華忠

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010018；2.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150080；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所，哈爾濱150080）

甜菜是我國(guó)重要的糖料作物之一，已經(jīng)確立為黑龍江省的主要農(nóng)作物。但由于中國(guó)不是甜菜起源國(guó)，缺少種質(zhì)資源，遺傳基礎(chǔ)狹窄，而且我國(guó)的甜菜育種多數(shù)仍然依賴(lài)于植株表型性狀的選擇及一些生理生化指標(biāo)的測(cè)定，很少?gòu)姆肿訕?biāo)記的遺傳層面進(jìn)行深入研究，致使育種水平提高緩慢。為了培育出適合黑龍江省的更為高產(chǎn)、抗病、高糖的甜菜新品種，避免遺傳基礎(chǔ)過(guò)于狹窄可能造成的危害，有必要對(duì)東北地區(qū)的甜菜資源進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析。近年來(lái)，我國(guó)有關(guān)甜菜的遺傳多樣性和分子標(biāo)記育種的研究已有所進(jìn)展。路運(yùn)才等[1]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)我國(guó)的15個(gè)甜菜多倍體品種，于歆等[2]應(yīng)用AFLP技術(shù)對(duì)甜菜雙豐系列的8個(gè)品種分別研究表明，我國(guó)甜菜的遺傳材料基礎(chǔ)狹窄。田自華等[3-4]對(duì)甜菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的線粒體DNA和葉綠體DNA進(jìn)行RAPD分析表明，甜菜不育系和保持系的葉綠體DNA之間不存在差異，而在線粒體DNA之間存在豐富的多態(tài)性。目前分子標(biāo)記技術(shù)主要包括AFLP、RFLP、SRAP、SSR、RAPD、ISSR等標(biāo)記方法[5-7]。SRAP（sequence-related amplified polymorphism）即相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性，又叫基于序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP），近幾年應(yīng)用比較廣泛。SRAP標(biāo)記在中國(guó)已成功應(yīng)用于棉花[8-9]、西瓜[10]、油菜[11]、蓮藕[12]、甘薯[13]和野牛草等植物[7]。 但利用 SRAP分析甜菜的并不多，選用的引物也較少。王華忠等[14-15]應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記分析了49個(gè)甜菜材料的遺傳多樣性，并對(duì)SRAP引物組合進(jìn)行了篩選以及甜菜SRAP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。本試驗(yàn)對(duì)94份東北地區(qū)甜菜品系材料和6個(gè)國(guó)外品種進(jìn)行SRAP分子標(biāo)記分析，從88對(duì)引物組合中篩選出有效引物組合33對(duì)，可以有效地對(duì)甜菜進(jìn)行分子標(biāo)記分類(lèi)和親緣關(guān)系分析，為指導(dǎo)種質(zhì)資源引進(jìn)，雜交組合親本選擇和分子標(biāo)記輔助選擇育種等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)參試材料共100份(見(jiàn)表1)，其中多胚二倍體品系48份，多胚四倍體品系35份，單胚雄性不育系和保持系11份，另有6份外國(guó)品種作對(duì)照。均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所選育或引進(jìn)的代表性材料。

1.2 方法

田間鑒定試驗(yàn)與生物學(xué)性狀調(diào)查在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所進(jìn)行，SRAP分子標(biāo)記分析在黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1 田間鑒定試驗(yàn)與生物學(xué)性狀調(diào)查 2008年4月25日，在中國(guó)農(nóng)科院甜菜研究所試驗(yàn)地種植不同類(lèi)型甜菜品系100份，隨機(jī)區(qū)組排列，4次重復(fù)，2行區(qū)，行長(zhǎng)10 m，株距25 cm。利用國(guó)際通用的Beta屬鑒定性狀的形態(tài)指標(biāo)及褐斑病病情進(jìn)行調(diào)查，收獲時(shí)測(cè)定根產(chǎn)量，調(diào)查根腐病株數(shù)，收獲后2～3 d檢測(cè)含糖率。每個(gè)材料按常規(guī)調(diào)查30株，計(jì)算平均數(shù)。經(jīng)濟(jì)性狀主要概括為如下6種類(lèi)型：高產(chǎn)高糖高抗型、高產(chǎn)高糖中抗型、高產(chǎn)中糖低抗型、高產(chǎn)中糖中抗型、高產(chǎn)低糖低抗型、中產(chǎn)高糖高抗型。

1.2.2 基因組DNA的提取 基因組DNA的提取采用改良CTAB法[16]，提取的DNA質(zhì)量和濃度采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（每孔加樣為 1μL 樣品 DNA、4μL ddH2O、1μL 6×Loading Buffer）。 樣品稀釋到 10 ng/μL，置-20℃冰箱中保存。

1.2.3 SRAP-PCR體系 在20μL SRAP-PCR體系中含2.5 mmol/L的dNTPs 1.6μL，1 U Taq DNA聚合酶，上下游引物各60 ng，模板DNA 40 ng，用重蒸水調(diào)整體系使終體積為20μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3 min；94℃l min，35℃l min，72℃l min 5個(gè)循環(huán)，隨后的35個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度提高到50℃，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.2.4 電泳分析檢測(cè) 本試驗(yàn)的PCR產(chǎn)物分別采用了BioRAD公司生產(chǎn)的電泳儀及電泳槽和北京六一廠生產(chǎn)的DYC-30電泳槽，電泳緩沖液均為1倍 TBE。前者6%變性聚丙烯酰胺凝膠分離，電泳時(shí)，先在70 W恒功率下預(yù)電泳30 min，然后把上樣孔中的氣泡充分驅(qū)逐干凈，點(diǎn)樣前取擴(kuò)增產(chǎn)物4 μL加2 μL 10倍上樣緩沖液（47.5 mL甲酰胺、2.0 mL 0.5 M EDTA、溴酚藍(lán)0.125 g，定容到50 mL）混勻在PCR儀上95℃變性處理5 min，上樣后用70 W恒功率，時(shí)間大約70 min。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)垂直板底部時(shí)，將膠剝下，按如下順序進(jìn)行顯色：將長(zhǎng)板放入2 L 10%的醋酸溶液中，輕輕搖動(dòng)30 min；蒸餾水中漂洗2次，每次3 min；染色（在2 L蒸餾水中加入2 g硝酸銀，3 mL甲醛）30 min；染色完畢后在蒸餾水中迅速漂洗3～4 s，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的碳酸鈉溶液中（其中含有3 mL甲醛，400 μL 10 mg/L的硫代硫酸鈉），在搖床上顯影至條帶清晰為止。后者8%變性聚丙烯酰胺凝膠分離，點(diǎn)樣前取擴(kuò)增產(chǎn)物4μL加雙色指示劑2μL混合（離心），每孔點(diǎn)樣5μL，上樣后調(diào)至100～160V大約2h將膠剝下按如下順序顯色：將膠置于100mL固定液中（10%無(wú)水乙醇，0.5%冰乙酸），脫色搖床上緩慢搖動(dòng) 6min，2次；倒去固定液，加入100mL 0.2%AgNO3溶液，脫色搖床上緩慢搖動(dòng) 12min；倒去AgNO3溶液，用100mL ddH2O清洗30s；加入0.002%硫代硫酸鈉100mL，脫色搖床上緩慢搖動(dòng)30s后倒去；加入100mL顯色液（1.5%氫氧化鈉，0.4%甲醛），脫色搖床上緩慢搖動(dòng)至肉眼看到清晰的DNA條帶；用清水將膠清洗數(shù)次；保鮮膜包好，讀條帶。

1.2.5 引物篩選 用4個(gè)有代表性的品系(27、51、70、95)對(duì)88對(duì)SRAP標(biāo)記組合（表2）進(jìn)行篩選。用多態(tài)性好、易于區(qū)分的引物組合進(jìn)行檢測(cè)。

表1 供試材料及其主要特性

1.2.6 遺傳多樣性分析 用篩選到的33對(duì)SRAP引物組合對(duì)100份材料的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將電泳圖譜上清晰出現(xiàn)的條帶記為“1”，同一位置無(wú)條帶記為“0”，獲得“0”和“1”組成的原始矩陣后，轉(zhuǎn)化為mega的標(biāo)準(zhǔn)格式，進(jìn)行聚類(lèi)分析。按Nei和Li等的方法，遺傳相似系數(shù)GS=2X12/（X1+X2），遺傳距離GD=-lnGS。其中X1、X2分別為成對(duì)比較的2個(gè)品種的擴(kuò)增帶數(shù)，X12為共有帶數(shù)。利用Mega3.1軟件分析，采用非加權(quán)類(lèi)平均法構(gòu)建聚類(lèi)圖。重復(fù)運(yùn)算1000次后獲得自展值(Boot-strap)，以百分?jǐn)?shù)值表示。利用軟件中的Compute over-all mean計(jì)算組內(nèi)品種間平均遺傳距離，用LSD法[14]檢驗(yàn)遺傳距離及相似性的差異顯著性。

表2 SRAP引物序列與名稱(chēng)

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)性狀分類(lèi)

根據(jù)材料的主要性狀和田間鑒定結(jié)果（表1），以經(jīng)濟(jì)學(xué)性狀分類(lèi)，依據(jù)根產(chǎn)量、含糖率、抗病性分為6類(lèi)，分別為高產(chǎn)高糖高抗型、高產(chǎn)高糖中抗型、高產(chǎn)中糖低抗型、高產(chǎn)中糖中抗型、高產(chǎn)低糖低抗型、中產(chǎn)高糖高抗型。一般而言，單胚雄性不育系和保持系以及雜交改良品系表現(xiàn)為高產(chǎn)、低糖、低抗，多胚二倍體品系表現(xiàn)為中產(chǎn)、高糖、高抗，多胚四倍體品系表現(xiàn)為高產(chǎn)、高糖、高抗，國(guó)外品種表現(xiàn)為高產(chǎn)、低糖、低抗，但是具有抗叢根病特性。

2.2 SRAP分子標(biāo)記的多態(tài)性分析

使用4個(gè)表型差異比較明顯的甜菜品系對(duì)88對(duì)SRAP引物組合進(jìn)行擴(kuò)增，共篩選出SRAP引物組合33對(duì)。SRAP標(biāo)記的多態(tài)性見(jiàn)表3，每對(duì)引物組合產(chǎn)生16～28條擴(kuò)增帶，33對(duì)引物組合共產(chǎn)生694條擴(kuò)增帶，其中有424條呈多態(tài)性，平均每個(gè)引物組合產(chǎn)生21.0條擴(kuò)增帶和12.8條多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率平均為61.0%。從結(jié)果上看，篩選出的33對(duì)引物在100份甜菜材料上均產(chǎn)生了數(shù)量不等的特異性條帶，多態(tài)性較豐富，較好地顯示了該作物的遺傳多樣性。東北材料與外國(guó)材料相比較，外國(guó)材料的擴(kuò)增條帶只有8～12條，而東北材料有16～28條之多，顯著多于外國(guó)材料。這表明東北材料與外國(guó)材料之間確實(shí)存在較大差異，有可能東北材料的基因組成比較復(fù)雜，有許多不良基因影響產(chǎn)量的表現(xiàn)。

表3 SRAP引物組合、擴(kuò)增帶數(shù)及多態(tài)性帶數(shù)

2.3 遺傳距離與遺傳相似性分析

利用33對(duì)SRAP引物組合產(chǎn)生的694條DNA片段計(jì)算94份材料的平均遺傳距離為0.3636，平均遺傳相似系數(shù)為0.6952。單胚不育系和保持系的遺傳距離的變動(dòng)幅度及平均遺傳距離最小，而平均遺傳相似系數(shù)最大，如編號(hào)25和26二者遺傳距離在單胚品系中最小0.1121，遺傳相似系數(shù)最大0.8940，因二者是一對(duì)同型的單胚不育系和保持系。多胚二倍體品系中，編號(hào)44和48遺傳距離較小0.1724，遺傳相似系數(shù)為0.8416，可能是由于二者親本來(lái)源相同。在多胚四倍體品系中編號(hào)91和94遺傳距離最小為0.1379，遺傳相似系數(shù)最大為0.8712，可能是由于來(lái)源于相近的誘變?cè)此隆６幪?hào)70和79遺傳距離最大0.4052，遺傳相似系數(shù)最小0.6668，說(shuō)明二者遺傳基礎(chǔ)較遠(yuǎn)。在國(guó)外品種中，編號(hào)95和96遺傳距離最小0.0690，遺傳相似系數(shù)最大0.9333，可能二者來(lái)源基本相同。以上分析顯示了各類(lèi)型材料之間的親緣關(guān)系和遺傳基礎(chǔ)不同。從遺傳相似系數(shù)平均值可見(jiàn)，國(guó)外引進(jìn)品種0.8642>單胚品系0.7910>多胚四倍體品系0.7497>多胚二倍體品系0.7101。說(shuō)明國(guó)外品種的性狀整齊，均屬于高產(chǎn)低糖抗叢根病型。相比之下，由于國(guó)產(chǎn)單胚品系、多胚二倍體和四倍體品系數(shù)量較多，遺傳基礎(chǔ)不同，基因組成比較復(fù)雜，所以遺傳相似系數(shù)相對(duì)較小。

2.4 聚類(lèi)分析

按照UPGMA方法進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到100份甜菜材料的SRAP聚類(lèi)圖（圖1），在遺傳距離0.20處，可將參試材料分為四大類(lèi)群，分別為高產(chǎn)低糖低抗型品系、中產(chǎn)高糖高抗型品系、高產(chǎn)高糖高抗型品系、高產(chǎn)低糖抗叢根病型的品系和外國(guó)品種。較好地顯示了甜菜材料豐富的遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)的差異性。第一類(lèi)群有 48 個(gè)材料 （圖 1 中從上至下的順序）， 編號(hào)為 2、3、22、18、16、27、28、25、26、23、24、12、13、21、29、31、38、36、11、30、37、42、51、55、19、43、8、40、4、6、7、14、32、47、44、48、34、49、83、5、9、1、75、17、33、15、20、68， 其中包括全部的單胚品系、2個(gè)多胚四倍體品系和大部分多胚二倍體品系，高產(chǎn)低糖低抗型占同類(lèi)型總數(shù)的77%。第二類(lèi)群有22個(gè)材料，編號(hào)為10、58、87、59、79、84、91、94、73、92、50、78、66、77、70、71、89、69、74、72、61、76，其中包括 4 個(gè)多胚二倍體品系和18個(gè)多胚四倍體品系，中產(chǎn)高糖高抗型占68%。第三類(lèi)群有20個(gè)材料，編號(hào)為67、90、54、80、60、64、62、63、65、88、81、85、86、82、93、52、53、56、57、41，包括 6 個(gè)多胚二倍體品系和14個(gè)多胚四倍體品系，其中75%為高產(chǎn)高糖高抗型。第四類(lèi)群有10個(gè)材料，編 號(hào) 為 35、39、45、46、98、100、99、97、95、96，包括4個(gè)多胚二倍體品系和6個(gè)外國(guó)引進(jìn)品種，其中高產(chǎn)低糖抗叢根病型占60%。分析可見(jiàn)，聚類(lèi)結(jié)果與材料的生物學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)性狀分類(lèi)基本吻合，其中具有相近親緣關(guān)系的材料首先聚到一起，如同型的單胚不育系和保持系 25號(hào)（JV834-2）和 26 號(hào)（JV34-2）二者遺傳距離在單胚品系中最小0.1121，遺傳相似系數(shù)最大0.8940，同型的單胚不育系和保持系23和24聚合到一起，遺傳距離為0.1466，遺傳相似系數(shù)為0.8636。由聚類(lèi)圖可見(jiàn)，國(guó)外引進(jìn)品種聚類(lèi)到一起，可能是由于參試的外國(guó)材料數(shù)量較少，而且性狀比較整齊，擴(kuò)增條帶只有8～12條。只有4個(gè)東北材料與外國(guó)材料聚類(lèi)到一起，可能是這幾個(gè)東北材料是外國(guó)引進(jìn)品種改良雜交而成，遺傳基礎(chǔ)相近之故。

3 討論

本次試驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于，選用的材料較多，樣本更加齊全，引物數(shù)量比以往增加較多，多態(tài)性較高，其中正向引物8個(gè)，反向引物11個(gè)，引物組合88對(duì)，篩選出可用引物數(shù)量多達(dá)33對(duì)，更有利于正確評(píng)價(jià)甜菜種質(zhì)資源的遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)，為育種親本選配和資源引進(jìn)提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。試驗(yàn)結(jié)果表明，SRAP分子標(biāo)記將參試材料分成四大類(lèi)，與田間經(jīng)濟(jì)性狀鑒定及生物學(xué)調(diào)查結(jié)果基本相符。說(shuō)明利用SRAP標(biāo)記能夠有效地進(jìn)行甜菜品種的分子標(biāo)記鑒定以及不同材料間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析。但是，試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了表現(xiàn)比較特殊的情況，如從聚類(lèi)圖來(lái)看，只有4個(gè)甜菜品系和外國(guó)品種歸為一類(lèi)，可能是由外國(guó)品種雜交改良而成，遺傳基礎(chǔ)相近。從SRAP擴(kuò)增條帶顯示來(lái)看，外國(guó)材料的多態(tài)性條帶只有8～12條，東北材料有16～28條之多，顯著多于外國(guó)材料，表明東北材料與外國(guó)材料之間確實(shí)存在較大差異，東北材料中缺少豐產(chǎn)基因型，這可能是由于中國(guó)材料的基因組成比較復(fù)雜，許多不良基因影響產(chǎn)量的表現(xiàn)。由聚類(lèi)圖譜分析，有些二倍體和四倍體被聚合到一類(lèi)，這可能是因其具有一定親緣關(guān)系或經(jīng)濟(jì)學(xué)性狀相似所致。國(guó)外引進(jìn)品種聚類(lèi)到一起，可能是由于參試的外國(guó)材料數(shù)量較少，性狀比較整齊，而且高產(chǎn)性狀突出，且抗叢根病所致。試驗(yàn)表明，只有通過(guò)現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)我國(guó)的甜菜種質(zhì)資源進(jìn)行詳細(xì)的分類(lèi)和研究，才能為甜菜遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、重要性狀基因標(biāo)記定位與克隆、分子標(biāo)記輔助選擇育種提供良好的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

試驗(yàn)表明，利用SRAP分子標(biāo)記可以有效地進(jìn)行甜菜品種的分子標(biāo)記鑒定以及不同材料間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析。該法是2001年Quiros博士利用SRAP技術(shù)對(duì)蕓薹屬作物甘藍(lán)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，獲得的片段有45%與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知基因相同[17]。作為一種新型的DNA分子標(biāo)記，SRAP標(biāo)記的特點(diǎn)為多態(tài)性高，產(chǎn)率中等；重復(fù)性好；操作簡(jiǎn)單；在基因組中分布均勻；較易對(duì)擴(kuò)增得到的目的片段進(jìn)行測(cè)序；引物具有通用性，而且其正向引物可以與反向引物兩兩搭配組合，因此用少量的引物可以得到多個(gè)引物組合，提高了引物的使用效率，降低試驗(yàn)成本。

4 結(jié)論

利用SRAP分子標(biāo)記能夠簡(jiǎn)便有效地進(jìn)行甜菜品種的分子標(biāo)記鑒定以及不同材料間的親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析。按照UPGMA方法進(jìn)行聚類(lèi)分析，在遺傳距離0.20處，可將東北地區(qū)的甜菜材料大致分為四大類(lèi)群，分別為高產(chǎn)低糖低抗型的單胚品系和多胚二倍體品系；中產(chǎn)高糖高抗型的多胚四倍體品系和二倍體品系；高產(chǎn)高糖高抗型的多胚四倍體品系和二倍體品系；高產(chǎn)低糖抗叢根病型的品系和外國(guó)引進(jìn)品種。聚類(lèi)結(jié)果與生物學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)性狀分類(lèi)基本吻合，較好地顯示了甜菜材料豐富的遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)的差異性。結(jié)果表明，東北地區(qū)甜菜材料具有豐富的遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)差異。中外材料的遺傳基礎(chǔ)存在明顯的差異,只有4個(gè)甜菜品系和外國(guó)品種歸為一類(lèi)，可能是由外國(guó)品種雜交改良而成，遺傳基礎(chǔ)相近。本試驗(yàn)不足之處在于只進(jìn)行了類(lèi)群劃分，反映了DNA水平上的遺傳差異，但是不能確定材料之間究竟是哪些基因位點(diǎn)上的差異，以后應(yīng)有目的地尋找豐產(chǎn)、高糖、抗性基因標(biāo)記，為甜菜育種開(kāi)辟新途徑。

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