王德成，王星，周文江，彭秀華，高謙

(1.教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學分子病毒學重點實驗室，復旦大學上海醫(yī)學院，上海 200032; 2.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508)

研究報告

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌皮膚膿腫小鼠感染模型的建立與評估

王德成1，王星1，周文江2，彭秀華2，高謙1

(1.教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學分子病毒學重點實驗室，復旦大學上海醫(yī)學院，上海 200032; 2.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，復旦大學附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508)

目的建立耐甲氧西林金黃葡萄球菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)小鼠皮膚膿腫感染模型，觀察膿腫形成動態(tài)變化及藥物對膿腫愈合的影響。方法45只SPF級裸鼠隨機分為PBS對照組、感染組及給藥組，用臨床分離鑒定的ST－239型MRSA菌株皮下注射感染裸鼠，對膿腫的形成過程進行時相性觀察，測定膿腫體積的變化，并通過H.E染色觀察皮膚的組織病理學改變。結(jié)果PBS處理組小鼠皮膚無膿腫形成，顯微鏡下皮膚各層結(jié)構(gòu)清楚;感染組和給藥組可見到典型的膿腫，臨床癥狀的時相性過程明顯，感染組小鼠皮膚真皮層的膠原纖維消失，可見大量炎性細胞浸潤，給藥組小鼠的膿腫體積在整個實驗周期內(nèi)低于感染組，且在第5天時與感染組相比有差異。結(jié)論成功建立MRSA小鼠皮膚膿腫感染模型，該模型的建立可為進一步研究來源于臨床MRSA菌株的病原特性、發(fā)病機制、治療方法等提供可靠的動物模型。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;皮膚膿腫;裸鼠

皮膚膿腫是一種常見疾病，主要發(fā)生在軀干，肢端，腋窩或頭頸部。導致膿腫形成的原因很多，如細菌感染或創(chuàng)傷等，其最常見的是金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌)。膿腫通常在較小的皮膚創(chuàng)傷后產(chǎn)生，可伴隨有局限性蜂窩織炎，淋巴管炎和發(fā)熱等特征。皮膚膿腫不僅能導致直接的皮膚損傷，而且還能導致系列的繼發(fā)性皮膚病或復發(fā)性感染。由于繼發(fā)性或復發(fā)性感染往往可誘發(fā)潛在的全身性疾病，尤其是糖尿病或機體免疫功能有缺陷。因此，深入研究皮膚膿腫的病原特性、發(fā)病機制和探索有效的防治措施，仍是臨床醫(yī)學領(lǐng)域的重大研究課題之一。

金葡菌是臨床和動物生產(chǎn)中的常見的一種重要病原菌，隨著各種耐藥菌株尤其是耐甲氧西林金葡菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)的流行，對人和動物健康及公共衛(wèi)生安全造成嚴重威脅［1－5］。金葡菌引起的皮膚疾病在臨床上呈多種癥狀表現(xiàn)，有急性、慢性及亞臨床型或潛在性感染。金葡菌可導致皮膚的持續(xù)、反復感染，難以痊愈，并長期存在于環(huán)境中不易根除。大量抗菌藥物的廣泛應用，已引起多種藥物耐受性菌株的不斷產(chǎn)生，從而使治療更加困難。因此，研究金葡菌的病原特性及其致病機制，對研發(fā)皮膚疾病的治療大有裨益。

建立一種符合臨床發(fā)病機制的皮膚膿腫動物模型，尤其是建立易操作、成本低、實驗結(jié)果再現(xiàn)性好的小動物感染模型，對研究本病的發(fā)病機制及其防治具有十分重要的價值。本研究探討了臨床分離的MRSA菌株接種裸鼠后誘發(fā)的膿腫特征，感染后皮膚膿腫體積的變化及組織病理改變，為進一步開展臨床分離菌株造成的皮膚疾病的致病機制研究和治療藥物開發(fā)，提供可靠的動物實驗感染模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:45只15～20 g左右SPF級的BALB/c裸鼠，來源于上海西普爾－必凱實驗動物有限公司【SCXK(滬)2005—0001】，小鼠飼養(yǎng)在ABSL2動物室。本研究的動物感染在上海市公共衛(wèi)生臨床中心動物中心完成【SYXK(滬)—0007】，實驗過程中供給專用飼料及飲水，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 MRSA菌株ST－239:菌株由上海華山醫(yī)院臨床檢驗科李敏博士分離并惠贈，本實驗室保存。該菌株為臨床分離菌，參照美國臨床實驗室標準委員會(NCCLS)標準，將細菌培養(yǎng)后進行MLST及SCCmec分型，鑒定該株細菌為ST－239型［6］。

1.2 方法

1.2.1 感染用菌株的培養(yǎng)與制備:ST－239 MRSA菌株的增殖。37℃，ST－239菌株在TSB(trypticase soy broth)培養(yǎng)基中振蕩過夜生長，第2天轉(zhuǎn)種新的TSB，當細菌長至對數(shù)生長期時，用無菌PBS快速洗滌2次，然后再用無菌PBS懸浮細菌至1×109CFUs/100 μL或1×108CFUs/50 μL。

1.2.2 感染實驗:45只裸鼠預飼7 d后，隨機分為3組:PBS對照組，ST－239感染組和萬古霉素藥物治療組。其中PBS對照組5只。感染組和藥物治療組各20只，在感染組和給藥組中以10只為單位，分為兩個小組(其中一個小組為采樣組，另一組為測定組)。感染組在其右側(cè)腹部皮下注射50 μL含1 ×108cfu的菌液，對照組接種50 μL無菌的PBS，藥物組先皮下注射108cfu/50 μL菌液，24 h后在膿腫局部注射萬古霉素［150 mg/(kg·w)，購自Am resco公司］。注射前小鼠稱重，在注射后10 d內(nèi)每天稱重并測量膿腫的長度與寬徑，按照V=(π/6·L· W2)計算膿腫的體積，其中L表示膿腫的長度，W表示寬徑。同時，每天隨機從采樣組中取1只小鼠處死，取感染處的皮膚，常規(guī)固定后制作組織切片，進行HE染色。

1.3 皮膚膿腫的病理學評價

1.3.1 皮膚膿腫臨床癥狀的觀察:對感染組、藥物組和對照組小鼠皮膚膿腫情況進行肉眼觀察，記錄膿腫部位皮膚顏色變化、是否有潰瘍和結(jié)痂等狀況，并拍照記錄。

1.3.2 膿腫體積的測定:每天兩次，分別用游標卡尺測定膿腫的長徑與寬徑，并按照公式［V=(π/6) L·W2］計算膿腫的體積(其中L表示長徑，W表示寬徑)，直至實驗結(jié)束。

1.3.3 組織切片制備與觀察:每天分別于感染組和給藥組中隨機取1只小鼠處死，并取膿腫處的皮膚放入4%的多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋，切片后，進行蘇木精－伊紅(H.E)染色，于光學顯微鏡下觀察病理組織學變化。比較觀察并記錄感染組和對照組的病理組織學特征，炎癥細胞的浸潤部位和數(shù)量等。

2 結(jié)果

2.1 ST-239 MRSA菌株感染后皮膚膿腫的形成過程

用108CFU的金葡菌經(jīng)過皮下注射后，第1天可在感染組和給藥組小鼠的腹部看到明顯的膿腫形成，但在PBS對照組中無任何變化，表明ST－239菌株能夠造成皮膚的感染，隨著感染時間的延長，感染處的膿腫也發(fā)生有規(guī)律的變化，在感染后的3～5 d時，部分小鼠感染處的皮膚開始出現(xiàn)潰瘍，感染處的皮膚破潰，并有膿汁流出(見圖1，彩插7);隨著實驗的繼續(xù)，到第7天時，有些小鼠潰瘍處的皮膚開始結(jié)痂，呈現(xiàn)自動愈合的動態(tài)過程。

2.2 M RSA感染后皮膚膿腫的體積變化過程

在整個實驗過程中，PBS組的小鼠沒有任何異常的皮膚癥狀出現(xiàn)，而在感染組和給藥組中，皮膚膿腫的體積均呈現(xiàn)一個動態(tài)的規(guī)律，即在感染的早期呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，以后逐步降低(圖2)，并且體積的變化與我們在臨床上觀察到的膿腫的動態(tài)發(fā)展過程相一致。在整個實驗過程中，ST－239感染組和給藥組小鼠的膿腫的體積在第5天差異有顯著性(圖2，P＜0.05)，表明藥物的使用在膿腫的發(fā)展過程有一定的影響，尤其是影響到后期的愈合。

圖2 MRSA感染過程中皮膚膿腫體積的動態(tài)變化Fig.2 The dynamic changes of the volume of skin MRSA－infected abscesses during the entire experimental period

2.3 不同組別中皮膚膿腫的組織病理學觀察

對不同處理造成感染的小鼠，分別于感染后每天取感染處的皮膚組織，常規(guī)固定包埋，制作5 μm組織切片，H.E染色后進行觀察。鏡檢發(fā)現(xiàn)，整個實驗周期內(nèi)PBS組小鼠皮膚各層結(jié)構(gòu)清晰，表皮層細胞層次分明，細胞結(jié)構(gòu)完整，真皮層中膠原纖維排列有序，結(jié)構(gòu)清晰整齊，毛囊和皮脂腺等結(jié)構(gòu)完整(圖3.A－C)。與正常皮膚的完整結(jié)構(gòu)相比，感染組和藥物組小鼠的皮膚表皮細胞層次遭到不同程度的破壞，結(jié)構(gòu)模糊不清，真皮乳頭層內(nèi)的皮脂腺結(jié)構(gòu)完全遭到破壞，腺泡濃縮成為一較大空腔。真皮膠原結(jié)構(gòu)遭到不同程度的破壞，在感染組和給藥組中膠原纖維斷裂，凝聚成片狀或條索狀，在其中有大量炎性細胞浸潤。而受細菌感染的皮膚膠原纖維完全斷裂，有大量紅染嗜伊紅類物質(zhì)沉積(圖3.D－I)。(圖3見彩插7。)

3 討論

MRSA是醫(yī)院感染中最常見的致病菌之一［7］。由于該細菌廣譜耐藥，并且傳播迅速，被研究者喻為“超級細菌”。MRSA可以感染傷口，包括醫(yī)療操作產(chǎn)生的傷口。它可以進一步地進入到人體中，引發(fā)嚴重的傳染病，是全球性院內(nèi)感染的重要致病菌之一［8－12］。還有研究表明，HIV感染者皮膚感染MRSA比普通人群明顯高，并且從HIV感染者皮膚組織中分離到相同的菌株，提示MRSA在其他疾病的共感染過程中也發(fā)揮了重要作用［13］。

MRSA主要是通過皮膚接觸而導致傳染，因此容易造成皮膚的感染如膿腫等的形成，或在皮膚受傷后的傷口處理時造成感染。當這種病菌通過傷口入侵患者或免疫力低下的人群后，會造成嚴重的感染，甚至導致死亡［8－12］。因此，建立皮膚感染模型研究MRSA的致病基因和感染機制，是研究對付這種“超級細菌”的藥物的基礎(chǔ)。本研究中，我們首次通過皮下注射臨床分離的MRSA建立膿腫模型，并對皮膚膿腫形成過程進行了時相性觀察，記錄了感染過程中膿腫體積的變化，并進一步比較了通過給藥處理后皮膚的組織病理學變化。建立了操作簡單、實驗結(jié)果穩(wěn)定、再現(xiàn)性好、病理變化與自然感染發(fā)病相似的小動物皮膚膿腫感染模型。為進一步研究MRSA臨床分離株的病原特性，致病機制等提供了可行的小動物感染模型。

金葡菌是臨床上導致皮膚疾病的主要原因之一，我們利用臨床分離的金葡菌作為感染用菌株，作為一種典型的MRSA菌株，該ST－239型菌株能夠?qū)е侣闶蟮钠つw病變，由于ST－239型MRSA在我國及東南亞地區(qū)的廣泛流行，暗示該型細菌具有重要的臨床意義［14－16］，因此該小鼠感染模型的建立對進一步研究該型菌株的基因功能和致病機制提供了很好的參考作用。

在本研究中感染組和給藥組的小鼠均表現(xiàn)為明顯的發(fā)病過程，通過對膿腫形成的時相性觀察和膿腫體積的測定，發(fā)現(xiàn)兩組小鼠的膿腫都比較明顯，但總的趨勢是給藥組小鼠的膿腫體積在整個實驗過程中低于感染組，并且在第5天時差異有顯著性，這可能與我們在實驗過程中使用的藥物劑量相對較低有一定關(guān)系，結(jié)果提示我們雖然給藥不能完全治療感染的膿腫，但在一定條件下能加速康復進程。本研究為進一步研究MRSA皮膚感染過程中的治療藥物的研制和藥效比較等提供了依據(jù)。

綜上所述，我們用臨床分離的ST－239型MRSA菌株，經(jīng)皮下注射感染方法，成功建立了小鼠的MRSA皮膚膿腫感染模型。該動物模型能夠全程監(jiān)測膿腫形成的時相性過程，具有操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定及再現(xiàn)性好等特點，為進一步研究MRSA皮膚感染疾病的發(fā)病機制和治療效果比較等提供了可靠的動物模型和實驗基礎(chǔ)。

(致謝:感謝上海華山醫(yī)院檢驗科李敏副研究員提供ST－239型MRSA菌株。)

(本文圖1，圖3見彩插7。)

［1］Grundmann HM，Aires－de－Sousa M Boyce J，et al.Emergence and resurgence of meticillin－resistant Staphylococcus aureus as a public－h(huán)ealth threat.［J］.Lancet，2006，368(9538):874－885.

［2］Daum RS，Seal JB.Evolving antimicrobial chemotherapy for Staphylococcus aureus infections:Our backs to the wall.［J］. Crit Care Med，2001，29(4 Supp l):N92－96.

［3］Zetola N，F(xiàn)rancis JS，Nuermberger EL，et al.Communityacquired meticillin－resistant Staphylococcus aureus:an emerging threat.［J］.Lancet Infect Dis，2006，6(12):753－755.

［4］Goldstein EJ，Citron DM，Warren YA，et al.Virulence characteristics of community－associated Staphylococcus aureus and in vitro activities of moxifloxacin alone and in combination against community－associated and healthcare－associated meticillinresistant and－susceptible S.aureus.［J］.J Med Microbiol，2008，57(4):452－456.

［5］Maltezou HC，Giamarellou H.Community－acquired methicillinresistant Staphylococcus aureus infections［J］.Int J Antimicrob Agents，2006，27(2):87－96.

［6］Li M，Diep BA，Villaruz AE，et al.Evolution of virulence in epidemic community－associated methicillin－resistant Staphylococcus aureus［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(14):5883－5888.

［7］Ayliffe GAJ.The Progressive intercontinental spread of methicillin－resistant Staphylococcus aureus［J］.Clin Infect Dis，1997，24(1):S74－S79.

［8］Rihn JA，Michaels MG，Harner CD.Community－acquired methicillin－resistant Staphylococcus aureus:An emerging problem in the athletic population［J］.Am J Sports Med，2005，33:1924－1929.

［9］King MD，Humphrey BJ，Wang YF，et al.Emergence of community－acquired methicillin－resistant Staphylococcus aureus USA 300 clone as the predominant cause of skin and soft－tissue infections［J］.Ann Intern Med，2006，144(5):309－317.

［10］Trinh TT，Short WR，Mermel LA.Community－associated methicillin－resistant Staphylococcus aureus skin and soft－tissue infection in H IV－infected patients［J］.J Int Assoc Physicians AIDS Care(Chic Ill)，2009，8(3):176－180.

［11］Diep BA，Sensabaugh GF，Somboona NS，et al.W idespread skin and soft－tissue infections due to two methicillin－resistant Staphylococcus aureus strains harboring the genes for Panton－Valentine Leucocidin［J］.J Clin Microbiol，2004，42(5):2080－2084.

［12］Klevens RM，Morrison MA，Nadle J，et al.Invasive methicillinresistant Staphylococcus aureus infections in the United States［J］.JAMA，2007，298(15):1763－1771.

［13］Crum－Cianflone NF，Burgi AA，Hale BR.Increasing rates of community－acquired methicillin－resistant Staphylococcus aureus infections among HIV－infected persons［J］.Int J STD AIDS，2007，18(8):521－526.

［14］王蓉，馬為，徐邦牢，等.廣州地區(qū)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分子流行病學研究［J］.現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2009，24(4):71－73.

［15］Cha HH，Moon DC，Choi CH，et al.Prevalence of the ST239 clone of methicillin－resistant Staphylococcus aureus and differences in antimicrobial susceptibilities of ST239 and ST5 clones identified in a Korean hospital［J］.J Clin Microbiol，2005，43(8):3610－3614.

［16］Feil EJ，Nickerson EK，Chantratita N，et al.Rapid detection of the pandemic methicillin－resistant Staphylococcus aureus clone ST 239，a dominant strain in Asian hospitals［J］.J Clin Microbiol，2008，46(4):1520－1522.

Establishm ent and Evaluation of a M ouse M odel of Skin Abscess by In fection w ith an Isolated M ethicillin-Resistant Staphylococcus aureus(MRSA)Strain

WANG De－cheng1，WANG Xing1，ZHOU Wen－jiang2，PENG Xiu－h(huán)ua2，GAO Qian1
(1.Key Laboratory of Medical Molecular Virology，Shanghai Medical College，F(xiàn)udan University，Shanghai200032，China;2.Shanghai Public Health Clinical Center，Public Health Clinical Center Affiliated to Fudan University，Shanghai 201508)

ObjectiveTo establish a skin abscess model in nude mice by infection of a clinically isolated methicillin－resistant Staphylococcus aureus(MRSA)strain，and evaluate the dynam ics of abscess formation and drug effect.MethodsForty－five specific pathogen free nude mice were random ly divided into three groups:the PBS，MRSA－infected and durg－treated infected groups.All the mice were inoculated by subcutaneous injection of MRSA suspension and the kinetics of abscess formation was monitored.The clinical changes and abscess volume were examined during the whole experimental period.Finally，the abscesses in different groups were examined and compared by histopathological observation using HE staining.ResultsThere were no skin abscess formed in the PBS group during the experimental period.Skin abscesses were observed in the MRSA－infected and drug－treated MRSA－infected groups.The volume of skin abscess was higher in the MRSA－infected mice than that in the drug－treated MRSA－infected animals.Moreover，severe histopathologic changes were observed in the MRSA－infected mice.ConlusionA nude mouse model of skin abscess has been successfully established by MRSA－infection.This model will provide a useful tool for studies on the pathogenic characteristics and pathogenesis of skin abscess caused by MRSA infection，and promote the development of effectivetherapeutic approaches in the future.

Methicillin－resistant Staphylococcus aureus(MRSA);Skin abscess;Nude mice

R－33

A

1005－4847(2010)03－0221－04

2009－12－02

上海市科委資助項目(編號:07DZ19503)。

王德成(1976－)，男，博士，研究方向:重要人畜共患病動物感染模型的建立。Tel:021－54237971，E－mail:wdc268@yahoo. com.cn