成鋼，蓋楠，熊德慧，胡維新

(中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心，長(zhǎng)沙 410078)

研究報(bào)告

東方田鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性

成鋼，蓋楠，熊德慧，胡維新

(中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心，長(zhǎng)沙 410078)

目的對(duì)影響東方田鼠胚胎成纖維細(xì)胞(M fEF)分離和培養(yǎng)的因素進(jìn)行探索，并觀察其生物學(xué)特性。方法取室內(nèi)繁殖飼養(yǎng)不同胎齡的東方田鼠胚胎分離成纖維細(xì)胞，通過(guò)原代和繼代培養(yǎng)，分析比較不同胎齡、不同血清濃度、不同胰蛋白酶濃度等因素對(duì)M fEF分離及培養(yǎng)的影響，觀察M fEF的生長(zhǎng)形態(tài)及其生物學(xué)特性。結(jié)果

M fEF為貼壁型生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多樣，呈梭形、不規(guī)則多邊形;采用0.125%的胰蛋白酶室溫消化12～13 d胚胎組織5 min，以DMEM培養(yǎng)基添加15%小牛血清分離培養(yǎng)M fEF的效果最佳;M fEF2～7代增殖最旺盛。結(jié)論獲得了實(shí)驗(yàn)室分離、培養(yǎng)M fEF的有效方法，為進(jìn)一步深入研究東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)機(jī)制以及開(kāi)展不同動(dòng)物成纖維細(xì)胞間比較研究奠定了基礎(chǔ)。

東方田鼠;胚胎成纖維細(xì)胞;生物學(xué)特性

A. 0.125%胰酶消化分離的原代12 d MF胎兒MfEF;B. 12 d MF胎兒原代組織塊培養(yǎng)第6 天;C. 12 d MF胎兒第3代MfEF培養(yǎng)48 h;D. 12 d MF胎兒MfEF培養(yǎng)第9代;E. MfEF第3代,HE染色;F. 復(fù)蘇的第3代MfEF培養(yǎng)72 h。圖1MfEF生長(zhǎng)形態(tài)A. MfEF isolated by 0.125% tryPsin from day 12 embryo; B. MfEF cultured from day 12 embryo tissue for 6 d; C. The 3rd Passage MfEF isolated from a day 12 embryo and cultured for 48 h; D. The 9th Passage MfEF isolated from a d12 embryo; E. 3rd Passage MfEF, HE staining; F. The recovered MfEF were cultured for 72 h.Fig.1The morPhology of Microtus fortis embryonic fibroblasts at different growth stages

東方田鼠(Microtus fortis，M f)是我國(guó)日本血吸蟲(chóng)病流行區(qū)洞庭湖湖州廣泛分布的一種優(yōu)勢(shì)鼠種，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一對(duì)日本血吸蟲(chóng)病有天然抗性的嚙齒類(lèi)哺乳動(dòng)物［1］。從60年代初發(fā)現(xiàn)M f可抗日本血吸蟲(chóng)感染到目前人們對(duì)M f展開(kāi)廣泛深入的研究已近50年，但至今還沒(méi)有相關(guān)M f細(xì)胞系的報(bào)道。胚胎成纖維細(xì)胞是相對(duì)容易培養(yǎng)的細(xì)胞系，用途廣泛。建立M f胚胎成纖維細(xì)胞(Microtus fortis embryonic fibroblasts，M fEF)系，是尋求M f發(fā)揮抗日本血吸蟲(chóng)作用的重要基礎(chǔ)，不僅可以緩解試驗(yàn)用M f的不足，而且還能深入挖掘和利用我國(guó)特有的物種遺傳資源。目前，對(duì)小鼠和人胚胎成纖維細(xì)胞相關(guān)研究較多［2～5］，M fEF的分離和培養(yǎng)尚為首次報(bào)道。M fEF有何生物學(xué)特性，是否與抗日本血吸蟲(chóng)作用相關(guān)，與人和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)有何異同等都值得深入研究。本研究探討了影響實(shí)驗(yàn)室M fEF分離和培養(yǎng)的因素，并對(duì)M fEF的生物學(xué)特性進(jìn)行研究探索，為實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)M fEF細(xì)胞和深入研究M f抗日本血吸蟲(chóng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 胚胎來(lái)源:20周齡(70～80 g)懷孕東方田鼠(長(zhǎng)江亞種人工封閉繁育第3代)，中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。

1.1.2 主要試劑:胰蛋白酶(上海生工有限公司)，DMEM(低糖)培養(yǎng)基(invitrogen公司)，新生牛血清(FBS)(杭州四季青生物工程有限公司)，青霉素、鏈霉素購(gòu)自華北制藥股份有限公司;臺(tái)盼藍(lán)(Sigma公司)，其余常用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 原代M fEF的培養(yǎng):取妊娠6～7 d、12～13 d的孕鼠，乙醚麻醉后無(wú)菌取出子宮，用PBS漂洗3次，棄除表面血污，剪開(kāi)子宮，取出帶有胎膜的胚胎，用鑷子撕破胎膜，取出胎鼠，剔除胎盤(pán)、胚頭、內(nèi)臟和四肢，無(wú)菌PBS漂洗3次，剔除可能附帶的脂肪組織、被膜結(jié)締組織、壞死組織以及紅細(xì)胞，將鼠胚軀干剪成約1 mm3的碎塊，放入離心管后用培養(yǎng)液反復(fù)吹打，靜置沉淀5 min，吸取上清于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，沉淀的組織塊分別采用組織塊貼壁法和胰蛋白酶消化法在含15%FBS、100 U/m L青霉素、100 U/m L鏈霉素的DMEM，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，實(shí)時(shí)觀察記錄不同培養(yǎng)方法細(xì)胞的狀態(tài)。

1.2.2 繼代M fEF的培養(yǎng):原代M fEF鋪滿培養(yǎng)瓶的80%～90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)條件同上。

1.2.3 不同胎齡胚胎對(duì)分離M fEF的影響:分別對(duì)6～7 d、12～13 d胎齡的M f分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，觀察不同胎齡細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況及增殖情況。

1.2.4 不同血清濃度對(duì)M fEF生長(zhǎng)的影響:取12～13 d胎兒的第3代M fEF接種至48孔板，每孔接種10 000個(gè)細(xì)胞，分別以10%和15%不同濃度血清培養(yǎng)，每種濃度重復(fù)3孔，用血球計(jì)數(shù)板每天計(jì)數(shù)取平均值，連續(xù)7 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 傳代次數(shù)對(duì)M fEF生長(zhǎng)及傳代的影響:對(duì)不同胎齡的M fEF原代培養(yǎng)成功后，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，對(duì)傳代次數(shù)，細(xì)胞形態(tài)變化等進(jìn)行記錄，照相和HE染色。

1.2.6 不同胰蛋白酶濃度對(duì)分離M fEF的影響:選擇0.125%和0.25%不同濃度的胰蛋白酶在室溫條件下消化12～13 d胎兒組織，觀察不同酶濃度和消化時(shí)間對(duì)分離原代M fEF的影響。

1.2.7 M fEF的凍存與復(fù)蘇:采用凍存體系分別為90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO及90%血清+10%甘油，按常規(guī)凍存程序凍存第2和第3代M fEF，凍存2周后取出細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活率。

1.2.8 M fEF培養(yǎng)上清殺傷日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)實(shí)驗(yàn): M fEF長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶95%時(shí)，無(wú)菌收獲第3和第4代M fEF培養(yǎng)液，2000 r/min離心10 min，取上清，以50%的濃度加到含脫尾尾蚴的24孔培養(yǎng)板中，尾蚴每孔100±20尾，每個(gè)樣本設(shè)立平行三孔，20%濃度的M f血清為陽(yáng)性對(duì)照，以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照，于37℃、5%CO2培養(yǎng)，96 h內(nèi)作連續(xù)體外殺傷日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)效果觀察。

2 結(jié)果

2.1 M fEF生長(zhǎng)形態(tài)觀察

M fEF在體外為貼壁生長(zhǎng)型細(xì)胞，原代培養(yǎng)細(xì)胞體積較小(圖1，A)，雜細(xì)胞較多，培養(yǎng)12 h后部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁，48h后大部分細(xì)胞仍懸浮于培養(yǎng)液中，貼壁細(xì)胞胞質(zhì)向兩端伸出偽足呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞體積逐漸增大，邊界清晰，立體感強(qiáng)，呈火焰狀、漩渦狀排列生長(zhǎng)(圖1，B)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，胞質(zhì)向培養(yǎng)瓶底部鋪展，細(xì)胞間界限模糊，無(wú)立體感，折光性強(qiáng)。M fEF繼代培養(yǎng)貼壁性能極佳，傳代1 h后即可牢固貼壁，傳代3次后可得到較純凈的M fEF(圖1，C)，HE染色M fEF胞核大呈橢圓形，約占細(xì)胞體積的三分之一(圖1，E)。圖1見(jiàn)彩插8。

2.2 不同胎齡對(duì)分離M fEF的影響

實(shí)驗(yàn)比較了6～7 d和12～13 d胎齡對(duì)分離培養(yǎng)M fEF的影響，6～7 d M f的胚胎(每胚約0.1 g)，組織柔嫩，采用剪碎后機(jī)械吹打即可獲得單細(xì)胞懸液，不必使用胰酶消化，但原代細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶需要7 d以上;12～13 d胎齡胚胎(每胚約0.4 g)宜采用胰酶消化，細(xì)胞培養(yǎng)4 d后即可傳代培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量多，純度好(圖1，A)。對(duì)不同胎齡胚胎組織，采用組織塊貼壁法均可培養(yǎng)出M fEF(圖1，B)，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶所需天數(shù)與胚胎日齡呈反比。

2.3 不同血清濃度對(duì)M fEF生長(zhǎng)的影響

在15%與10%血清濃度培養(yǎng)基中，M fEF分別在培養(yǎng)第2天和第3天進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，培養(yǎng)第4、第5天達(dá)到生長(zhǎng)高峰，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞逐漸衰亡，數(shù)量迅速減少，二者均沒(méi)有穩(wěn)定的平臺(tái)期。實(shí)驗(yàn)表明:10%和15%血清濃度的培養(yǎng)基均可用于M fEF的培養(yǎng)，但前者M(jìn) fEF增殖相對(duì)緩慢，15%血清濃度的培養(yǎng)基更適宜M fEF生長(zhǎng)(圖2)。

2.4 傳代次數(shù)對(duì)M fEF生長(zhǎng)的影響

對(duì)M fEF繼代培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn):6～7 d胎齡胚胎2～5代增殖較為旺盛，約3～4 d即可傳代一次，從第6代起，細(xì)胞已不能隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增殖;12～13 d胎齡胚胎2～7代增殖較為旺盛，第8代以后，細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則多邊形，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞間黏度增大;傳至第9代時(shí)，細(xì)胞成簇疊加生長(zhǎng)，細(xì)胞間界限模糊，胞質(zhì)收縮，出現(xiàn)衰亡特征(圖1，D)。

2.5 不同胰蛋白酶濃度對(duì)分離M fEF的影響

本實(shí)驗(yàn)分別采用0.125%和0.25%兩種濃度的胰蛋白酶在室溫條件下消化12～13 d M f胎兒組織后發(fā)現(xiàn):在組織量和消化時(shí)間均相同的情況下0.125%較0.25%胰蛋白酶分離的細(xì)胞密度大，活力好，貼壁細(xì)胞多，速度快，是實(shí)驗(yàn)室分離M fEF合適的胰蛋白酶濃度(圖1，A)。

2.6 M fEF的凍存與復(fù)蘇

對(duì)10%DMSO和10%甘油凍存2周后的第2、第3代M fEF分別進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活率均達(dá)90%以上，鏡下觀察，細(xì)胞不著色，折光性強(qiáng)，形態(tài)完整。接種培養(yǎng)后4 h開(kāi)始貼壁，24 h后呈典型的M fEF形態(tài)，兩種凍存體系在細(xì)胞活率、貼壁時(shí)間、傳代時(shí)間等指標(biāo)沒(méi)有明顯差別，都適用于M fEF的凍存(圖1，F(xiàn))。

2.7 M fEF培養(yǎng)基殺傷日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)

第3和第4代M fEF培養(yǎng)上清液與日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)共培養(yǎng)96 h后，童蟲(chóng)死亡率分別達(dá)到15.1%和 13.3%，與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH/3T3培養(yǎng)上清和陽(yáng)性對(duì)照的童蟲(chóng)死亡率9.3%與45.6%相比沒(méi)有明顯的殺傷效果(圖3)。

圖2 不同血清濃度對(duì)M fEF生長(zhǎng)的影響Fig.2 Influence of different serum concentrations on the growth of M fEF

圖3 M fEF培養(yǎng)上清與童蟲(chóng)共培養(yǎng)96 h后減蟲(chóng)率Fig.3 The killing effect of M fEF culture supernatant on the co－cultured schistosomulum for 96 h

3 討論

通過(guò)對(duì)M fEF進(jìn)行初步分離培養(yǎng)，并對(duì)M fEF的生物學(xué)特性進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞特性許多不同。與小鼠相比M fEF維持傳代時(shí)間更長(zhǎng)，而且傳代次數(shù)與M f胚胎胎齡相關(guān)，胎齡越小傳代次數(shù)越少，12～13 d胎齡胚胎可穩(wěn)定傳代8次以上;M fEF傳代1 h后即可牢固貼壁，用吸管吹打不易脫落;M fEF透光性較好，長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶后鏡下觀察不易分辨細(xì)胞輪廓，以上特性可能由于M f與小鼠的染色體數(shù)目差別較大，種屬差異有關(guān)。已報(bào)道胚胎成纖維細(xì)胞可以向培養(yǎng)液中分泌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast grow th factor，F(xiàn)GF)，白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白－4(insulin－like growth factor－binding protein 4，IGFBP－4)，色素上皮衍生因子(pigment epithelium derived factor，PEDF)等諸多蛋白成分，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)生成、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化與凋亡等作用［6］?；谝陨峡紤]，我們把第3和第4代M fEF培養(yǎng)上清液與日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照相比M fEF培養(yǎng)上清液對(duì)日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)有一定的殺傷作用，但殺傷效果不顯著，以上結(jié)果與申群喜等［7］將日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)與M f心臟、肝、肺、腎、脾和肌肉的勻漿上清液混合培養(yǎng)結(jié)果相一致，實(shí)驗(yàn)提示M f抗日本血吸蟲(chóng)作用的主效分子主要存在于血清中，應(yīng)重點(diǎn)從M f血清中篩選抗性成分。M fEF系的建立可為M f的相關(guān)研究提供細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA、RNA樣本，與活體樣本相比，細(xì)胞系可以連續(xù)培養(yǎng)，反復(fù)凍存，便于管理和使用，而且不會(huì)因?yàn)閭€(gè)體遺傳差異和生理狀態(tài)影響實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，還可完成如蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)基因、免疫熒光、RNA干擾等相關(guān)實(shí)驗(yàn)。由于M fEF不能在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，我們已展開(kāi)對(duì)M fEF永生化篩選的工作，并已取得一定進(jìn)展。

(本文圖1見(jiàn)彩插8。)

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Isolation，Culture and Biological Characteristics of Em bryonic Fibroblasts from M icrotus fortis

CHENG Gang，GAI Nan，XIONG De－h(huán)ui，HU Wei－xin
(Molecular Biology Research Center，School of Biological Science and Technology，Central South University，Changsha 410078，China)

ObjectiveThe aim of this study was to isolate，culture，and characterize embryonic fibroblasts from Microtus fortis(M fEF).M ethods The primary embryonic fibroblasts were isolated from Microtus fortis fetus at different gestational ages.According to the influence of different serum and trypsin concentrations and different gestational ages，the growth behavior and the biological characteristics of M icrotus fortis embryonic fibroblasts(M fEF)were studied.ResultsThe M fEF in vitro appeared as adherent cells with good ability for proliferation in passages 2－7.The optimal gestational age for isolation of M fEF was from day 12 to 13.At the temperature of 20℃to 25℃，the optimal time for digestion of fetal tissue to obtain fibroblasts was 5 min with a digestion solution containing 0.125%of trypsin.The M fEF were cultured in DMEM(low glucose)supp lemented with 15%FBS.ConlusionEmbryonic fibroblasts of M icrotus fortis have been successfully isolated and cultured，which lay the foundation for further studies on Microtus fortis against Schistosma japonicum infection and for comparative study of fibroblasts between different animals.

M icrotus fortis;Embryonic fibroblasts;Biological characteristics

Q25

A

1005－4847(2010)03－0254－04

2009－11－2

湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目資助(No.2340－74236000001)。

成鋼(1976－)，男，講師，博士研究生，研究方向:東方田鼠抗日本血吸蟲(chóng)抗性相關(guān)基因篩選。E－mail addresses:chenggang876@ 126.com

胡維新(1950－)，男，教授，博士生導(dǎo)師。E－mail addresses:weixinhu@yahoo.com.cn