巨向紅，徐漢進，雍艷紅，安立龍，效梅，許英梅

(1.廣東海洋大學(xué)動物醫(yī)學(xué)系，湛江 524088;2.廣東海洋大學(xué)動物科學(xué)系，湛江 524088)

研究報告

巴馬香豬Toll樣受體4基因cDNA的克隆及生物信息學(xué)分析

巨向紅1，徐漢進2，雍艷紅1，安立龍2，效梅1，許英梅2

(1.廣東海洋大學(xué)動物醫(yī)學(xué)系，湛江 524088;2.廣東海洋大學(xué)動物科學(xué)系，湛江 524088)

目的研究TLR4在豬自然免疫中的作用及機制，為抗病育種及免疫佐劑的開發(fā)提供依據(jù)。方法利用NCBI公布的TLR4基因序列設(shè)計引物，RT－PCR技術(shù)克隆巴馬香豬TLR4基因。結(jié)果所得基因序列提交GenBank，登錄號:GQ304754。經(jīng)序列分析，發(fā)現(xiàn)巴馬香豬TLR4基因開放閱讀框長2526 bp，編碼785個氨基酸，該蛋白等電點為6.58，分子量為96.4×103;與普通豬比對發(fā)現(xiàn)巴馬香豬TLR4基因有5個堿基發(fā)生突變;與小鼠、狗、雞、牛、羊和人的同源性分別為71.9%、81.5%、54.2%、86.4%、85.5%和81.9%;TLR4膜外區(qū)蛋白為背側(cè)多個α螺旋和內(nèi)側(cè)多個β折疊平行交替排列構(gòu)成一個彎曲狀螺旋結(jié)構(gòu);N末端存在信號肽，且可能在23～24位氨基酸處存在裂解位點;胞外區(qū)有13個明顯的LRR，分別位于第53～74、77～100、101～124、149～173、174～192、201～225、372～393、398～429、446～469、470～494、495～518、519～541、543～566位氨基酸區(qū);膜外區(qū)含8個N連接的糖基化位點。結(jié)論本研究成功克隆巴馬香豬TLR4基因，為進一步研究該基因的功能和蛋白質(zhì)的特性奠定了基礎(chǔ)。

豬;Toll樣受體;生物信息學(xué)分析

Toll－like receptors 4(TLR4)表達于許多的免疫和非免疫細(xì)胞，活化TLR4將誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列的炎癥介質(zhì)包括細(xì)胞因子、趨化因子等從而產(chǎn)生強有力的炎癥反應(yīng)。最初的研究發(fā)現(xiàn)TLR4是革蘭陰性細(xì)胞細(xì)胞壁成分脂多糖(LPS)的識別受體。近來的研究顯示紫杉醇、呼吸道合胞病毒的融合蛋白、鼠乳腺腫瘤病毒的包膜蛋白、熱休克蛋白60(heat shock protein 60，HSP60)、HSP70，纖連蛋白透明質(zhì)酸寡聚糖、硫酸肝素多聚糖片段、纖維蛋白原以及HMGB1 ju均能活化TLR4［1，2］，表明TLR4在抗細(xì)菌、抗病毒的炎癥反應(yīng)及應(yīng)激狀態(tài)下均發(fā)揮重要作用，深入研究TLR4意義重大。

巴馬香豬產(chǎn)于廣西巴馬縣及周邊地區(qū)，其肉味鮮香，乳豬可食并鮮嫩可口，故得名“香豬”［3］。由于處在交通閉塞的邊遠(yuǎn)山區(qū)，經(jīng)過長期的近交，基因高度純合，并且其體型矮小，性成熟早，已成為生命科學(xué)研究中重要的模式動物。但目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)巴馬香豬TLR4的研究，因此本研究通過RT－PCR克隆了巴馬香豬TLR4基因，通過生物信息學(xué)方法對其進行結(jié)構(gòu)分析，為進一步研究豬TLR4基因的功能及其在免疫調(diào)節(jié)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

前腔靜脈采集12頭2月齡健康巴馬香豬血液。淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個核細(xì)胞。巴馬香豬購自廣西巴馬香豬原種場。

1.2 主要試劑

RNAiso plus、pMD18－T載體、PrimeScript 1st strand cDNA synthesis kit、Agarose gel DNA purification kit、ExTaq酶購自大連TaKaRa公司，淋巴細(xì)胞分離液購自廣州展晨公司。大腸桿菌工程菌DH5α為本實驗室保存。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成:根據(jù)GenBank已發(fā)表的豬TLR4基因序列(NM_001113039)，利用Prem ier 5.0軟件設(shè)計擴增TLR4基因編碼區(qū)全長PCR引物。上游引物:5′－ATGATTCCTCGCATCCGC－3′，下游引物:5′－CAAGGGACACGTTGGGAGTT－3′，擴增片段長2554 bp。引物由上?；瞪锕竞铣伞?/p>

1.3.2 RT－PCR:首先提取巴馬香豬外周血單核細(xì)胞總RNA，具體步驟按照RNAiso plus試劑盒說明書進行?？俁NA用DEPC水充分溶解，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，－70℃保存?zhèn)溆?。根?jù)PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA第一鏈合成，具體步驟按說明書進行。然后PCR擴增，反應(yīng)體系為:14.3 μL滅菌二蒸水，2.5 μL 10×PCR buffer，2.5 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix，1 μL 10 μmol/L primer I，1 μL 10 μmol/L primer II，0.2 μL 0.5 U/ μL Taq酶，1 μL cDNA模板。反應(yīng)條件為94℃5 min，94℃1 min，55℃30 s，72℃2 min，30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 目的基因回收與測序:經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定有特異性條帶，回收純化產(chǎn)物，連接于pMD－18T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α菌，涂布平板，進行藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆接種于10 m L LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴增進行初步鑒定，陽性質(zhì)粒送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序。

1.3.4 序列分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測:利用DNAman軟件將克隆所得到的序列與GenBank上已發(fā)表的普通豬、人、小鼠、牛、羊和雞的同源性進行比較;用NCBI中的ORF Finder軟件進行開放閱讀框的識別;翻譯成氨基酸序列，ESyPred3D Web Server 1.0同源建模對TLR4蛋白進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測;Signal P3.0預(yù)測TLR4蛋白的N端信號肽結(jié)構(gòu)，TMHMM Server v. 2.0預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)，SMART service預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域，NetGlyc1.0 Server進行N－糖基化位點預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 RNA完整性及PCR產(chǎn)物的特異性分析

對提取的RNA進行電泳分析，結(jié)果可明顯地觀察到28 s、18 s和5 s三條帶(圖1－A)，說明所提取RNA完整性良好。對RT－PCR產(chǎn)物的特異性進行電泳分析，結(jié)果顯示TLR4 PCR產(chǎn)物特異性良好，在2500 bp左右出現(xiàn)目的條帶(2554 bp)(圖1－B)。

2.2 重組質(zhì)粒PCR鑒定

質(zhì)粒電泳結(jié)果顯示2500 bp左右有目的條帶(2554 bp)出現(xiàn)(圖1－C)，說明TLR4目的片段已插入到載體當(dāng)中。

注:A為RNA電泳結(jié)果;1、2為RNA樣品，M為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。B為PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果;M為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為PCR產(chǎn)物。C為重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物電泳圖;M為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1、2為重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。圖1 RNA、PCR產(chǎn)物及重組質(zhì)粒電泳結(jié)果Note:Figure 1A shows the electrophoresis result of total RNA.1 and 2 represent RNA sample and M is marker.Figure 1B shows the electrophoresis results of RT－PCR products of TLR4 gene.M is marker and 1 is the RT－PCR product.Figure 1C shows the electrophoresis result of recombinant p lasmid PCR products.M is marker and 1 and 2 are the recombinant plasmid PCR products.Fig.1 The results of electrophoresis of Total RNA，RT－PCR products of TLR4 and recombinant plasmid.

2.3 TLR4基因測序結(jié)果及分析

核苷酸序列測序結(jié)果表明，巴馬香豬TLR4基因開放閱讀框全長2358 bp，編碼785個氨基酸。將巴馬香豬TLR4測序結(jié)果用DNAman軟件與GenBank中登錄的豬TLR4(NM_001113039)的核苷酸序列及氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)巴馬香豬TLR4編碼區(qū)核苷酸序列有5個堿基被替換，結(jié)果造成了5個無義突變(表1)。突變位置在圖6中以粗線方框標(biāo)出。

2.4 巴馬香豬TLR4的同源性分析

用DNAman軟件將巴馬香豬TLR4測序核苷酸序列與GenBank中登錄的普通豬(NM213761)、狗(NM001005264)、雞(NM204278)、牛(NM174197)、人(NM003264)、小鼠(NM011905)和羊(NM001048231)的參考序列進行比對(圖2)，發(fā)現(xiàn)巴馬香豬與普通豬同源性達到99.8%，與牛和羊的同源性較高，分別為86.4%和85.5%。與人、狗和小鼠的同源性分別為81.9%、81.5%和71.9%。與雞同源性最低，僅為54.2%。將巴馬香豬TLR4基因翻譯成氨基酸，與GenBank中登錄的普通豬、狗、雞、牛、人、小鼠、羊參考序列進行比對，發(fā)現(xiàn)同源性分別達到99.4%、70.8%、44.9%、80.0%、72.5%、62.4%和79.2%。預(yù)測巴馬香豬TLR4蛋白等電點為為6.58，分子量為96.4×103。

表1 與普通豬進行序列比對巴馬香豬TLR4堿基突變Tab.1 The TLR4 base mutation in Bama miniature pig compared with that in common pigs

注:“－”表示保守氨基酸;“.”表示氨基酸缺失。圖2巴馬香豬TLR4氨基酸序列與其他動物比對Note:“－”indicates conservative amino acid;“.”indicates amino acid deletion.Fig.2 Comparison of the identical alignment of the amino acid sequences of Bama miniature pig TLR4 with that of common pig，cattle and chicken.

2.5 三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

ESyPred3D Web Server 1.0同源建模對TLR4蛋白進行三維結(jié)構(gòu)預(yù)測，得到TLR4膜外區(qū)的立體三維結(jié)構(gòu)。預(yù)測結(jié)果表明，TLR4膜外區(qū)蛋白由背面多個α螺旋和內(nèi)面多個β折疊構(gòu)成。α螺旋和β折疊平行交替排列，構(gòu)成一個彎曲狀螺旋結(jié)構(gòu)(圖3，彩插1)。

2.6 TLR4信號肽預(yù)測

Signal P3.0預(yù)測TLR4蛋白的N端信號肽結(jié)構(gòu)，其中Signal P－NN預(yù)測信號肽裂解點［4］。結(jié)果表明，在23～24位氨基酸可能存在裂解位點。

2.7 跨膜結(jié)構(gòu)分析

TMHMM Server v.2.0預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，巴馬香豬TLR4分子可能是由胞外區(qū)(1－588)、跨膜區(qū)(589－611)、胞內(nèi)區(qū)(612－785)3部分組成的膜蛋白(圖4，彩插1)。

2.8 保守結(jié)構(gòu)域分析

SMART service預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白胞外區(qū)有13個明顯的LRR，分別位于第53～74，77～100，101～124，149～173，174～192，201～225，372～393，398～429，446～469，470～494，495～518，519～541，543～566位氨基酸區(qū)(圖5，彩插1)。13個LRR在圖2三維結(jié)構(gòu)中分別以黃色標(biāo)記、分別為LRR1、LRR2、LRR3、LRR4、LRR5、LRR6、LRR7、LRR8、LRR9、LRR10、LRR11、LRR12、LRR13。在LRR區(qū)之后是胞外肽鏈C端基序LRR－CT(579－628)。

2.9 糖基化位點分析

根據(jù)NetGlyc1.0 server進行N－糖基化位點預(yù)測，發(fā)現(xiàn)TLR4胞外區(qū)存在8個N－連接的糖基化位點(圖6，以細(xì)線方框標(biāo)記)。N－糖基化位點在圖3三維結(jié)構(gòu)中采用RasMol軟件以紫色標(biāo)記為Asn35、Asn205、Asn238、Asn282、Asn309、Asn526、Asn575和Asn625。

注:細(xì)線方框標(biāo)記為預(yù)測的糖基化位點，粗線框方框標(biāo)記為氨基酸突變位點。圖6 TLR4蛋白糖基化位點預(yù)測Note:The glycosylation sites are marked with fine frame and mutation of amino acid with coarse frameFig.6 The predicted glycosylation sites of the TLR4 protein

3 討論

隨著對TLR4的分子結(jié)構(gòu)、識別受體、信號傳導(dǎo)途徑及基因缺陷型動物模型等研究的深入，其在機體免疫系統(tǒng)中的重要性也日益得以認(rèn)識。本實驗運用RT－PCR方法克隆了巴馬香豬TLR4基因編碼區(qū)，與普通豬TLR4基因進行序列比對，巴馬香豬TLR4出現(xiàn)了5處有義突變，其中兩個突變發(fā)生在胞內(nèi)區(qū)。由于胞內(nèi)區(qū)與信號的傳導(dǎo)密切相關(guān)，因此胞內(nèi)區(qū)的突變很容易影響TLR4正常功能的發(fā)揮以及對疾病的易感性。White等［5］發(fā)現(xiàn)牛TLR4編碼區(qū)第274～368殘基位置是一個變異頻發(fā)區(qū)，這一區(qū)域在不同物種之間保守性非常低，即使在同一物種內(nèi)突變率也較高，因此認(rèn)為此位置參與對病原分子的連接綁定。Thomas等［6］認(rèn)為這一變異頻發(fā)區(qū)的多態(tài)性可能反映了豬對疾病易感性模式的不同。比對發(fā)現(xiàn)巴馬香豬TLR4與普通豬TLR4在這一變異頻發(fā)區(qū)序列完全一致，沒有發(fā)生任何變異突變。對其核苷酸序列的同源性比較后發(fā)現(xiàn)，巴馬香豬TLR4與普通豬同源性極高，與牛、羊、狗、人和鼠有較高相似性，與雞同源性較差。這說明在TLR4長期的生物進化過程中具有較強保守性。

同源建模預(yù)測分析表明，巴馬香豬TLR4膜外區(qū)蛋白由背面多個α螺旋和內(nèi)面多個β折疊構(gòu)成。信號肽預(yù)測表明TLR4存在典型的信號肽結(jié)構(gòu)，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明TLR4存在典型的跨膜結(jié)構(gòu)，這與Thomas等［6］報道的TLR4結(jié)構(gòu)一致。Bella等［7］認(rèn)為LRR結(jié)構(gòu)作為蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的調(diào)節(jié)模式非常適合。在目前已知的LRR綁定復(fù)合物中，一般認(rèn)為LRR螺線管結(jié)構(gòu)的凹面就是鏈接綁定位點。但最近的研究發(fā)現(xiàn)一些LRR結(jié)構(gòu)使用他們的凹面形成穩(wěn)定的二聚體［8，9］，這說明LRR能用其他的綁定模式［10］。Alvarez［11］認(rèn)為普通豬TLR4第279～373位置還存在4個首尾相連的串聯(lián)LRR，并認(rèn)為此處可能是連接綁定位點。這4個LRR在不同物種之間的同源性非常低，并且有研究認(rèn)為正是TLR4的這個串聯(lián)LRR區(qū)域?qū)е铝耸蠛腿祟愒趨^(qū)分不同類型LPS上能力有所差別［12，13］。Kobe［14］研究發(fā)現(xiàn)TLR5與鞭毛蛋白的連接綁定位點位于LRR14上，LRR14有32個殘基，這揭示LRR14第15位后面插入了6個殘基，正是這6個殘基使得TLR5與鞭毛蛋白相結(jié)合。巴馬香豬TLR4的胞外結(jié)構(gòu)域具有13個明顯的LRR，符合TLR的胞外結(jié)構(gòu)特征。其中的LRR部分構(gòu)成配體結(jié)合區(qū)。TLR4胞外區(qū)三維結(jié)構(gòu)呈彎曲的螺線管狀，其凹面LRR區(qū)富含疏水氨基酸殘基，從而形成一個疏水核心。LRR4，LRR6和LRR10第10位后均有一個殘基插入，而LRR1、LRR5、LRR7、LRR8和LRR12均有殘基丟失，我們認(rèn)為這種現(xiàn)象可能與TLR4功能的特異性有關(guān)。糖基化是蛋白質(zhì)的一種修飾方式。主要是修飾天冬酰胺上的N，其氨基酸的特征序列是Asn－X－Ser/Thr(X代表任何一種氨基酸)。近年來發(fā)現(xiàn)，糖蛋白中的糖鏈參與細(xì)胞識別與分子識別，因此稱糖蛋白中的糖鏈為信息分子［15］。朱立平［16］認(rèn)為糖鏈?zhǔn)抢^核酸鏈與蛋白質(zhì)鏈之后，學(xué)者們深入研究與生命活動息息相關(guān)的第三鏈。本研究發(fā)現(xiàn)TLR4胞外區(qū)存在8個N－連接的糖基化位點。其中第4和第5個糖基化位點Asn238和Asn282位于4個串聯(lián)LRR上，由于此區(qū)域可能是連接綁定位點，該區(qū)域的糖基化很容易阻止TLR4與PAMPs的綁定結(jié)合。這些位置的糖基化可能與TLR4功能的發(fā)揮密切相關(guān)。

(本文圖3～5見彩插1。)

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Cloning and Bioinform atics Analysis of TLR4 cDNA in Bam a M iniature Pig

JU Xiang－h(huán)ong1，XU Han－jin2，YONG Yan－h(huán)ong1，AN Li－long2，XIAO Mei1，XU Ying－mei2
(1.Department of veterinary medicine，2.Department of Animal Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

ObjectiveBama Miniature pig is originated in the Chengguan area of Bama County and Yiwei area of Dongtian County in Guangxi Zhuang Autonomous Region of China.The form of this breed is the results of long time inbreeding，so the heredity and production performance is very stabilized，and are used as an experiment animal model normally.Toll－like receptor 4(TLR4)is an important member of Toll－like receptor family，it mainly responses to lipopolysaccharide(LPS)and plays a vital role in the host immune system.In order to explore the molecular mechanism of TLR4 participating in immunosuppression induced by heat stress in Bama Miniature Pigs.The present study is conducted to clone the TLR4 gene cDNA and make bioinformatics analysis of the protein after translated into amino acids.M ethods Total 12 bama miniature pigs aged approximately 3－4 months were used in this study.One milliliter blood was collected into vacutainers by anterior vena cava puncture.Lymphocytes were isolated from 1 mL of whole blood by density gradient centrifugation using LTS－1077 lymphocyte separation solution.TLR4 gene was cloned from peripheral blood mononuclear cells by reverse transcription polymerase chain reaction(RT－PCR).The Identical alignment of the amino acid sequence was compared with other animals by DNAman software.Homology modeling to prediction the three－dimensional structure models of TLR4 extracellular region was conducted by ESyPred3D Web Server 1.0 software.The N－terminal signal peptide structure was predicted by Signal P3.0 software.The transmembrane region structure was predicted by TMHMM Server v.2.0 software.The conserved domain region was predicted by SMART service software and the N－glycosylation site by NetGlyc1.0 Server software.ResultsThe results showed that Toll－like receptor 4 gene consisted of 2358 base pairs.The gene sequence was submitted to GenBank(gi:GQ304754).The TLR4 gene coded 785 amino acids.The molecular weight of TLR4 protein was 96.4 kD and the isoelectric point was 6.58.This protein had a transmembrane region(589－611)and a signal peptide in N－terminal，and might be a schizolysis site in 23－24 amino acids.5 bases of TLR4 gene in Bama miniature pig were mutated compared with that of common pig，but the structure did not change significantly.The Bama miniature pig TLR4 gene sequence had a high homology compared with that of mice(73.4%)，dog(82.4%)，chicken(59.5%)，cattle(85.3%)，sheep(84.6%)and man(82.4%).The structure of extracellular region of TLR4 protein showed a forniciform helix structure，and consisted of a lot of α－h(huán)elix in inside and β－sheet in outside of the arc and they arranged parallely and alternately.There were thirteen leucine－rich repeats located at 53－74，77－100，101－124，149－173，174－192，201－225，372－393，398－429，446－469，470－494，495－518，519－541 and 543－566 amino acid site，respectively，and there were also 8 N－linked glycosylation sites out of the membrane region.ConlusionTLR4 gene of Bama miniature pigs has been successfully cloned and the possible structure and function are pretested by bioinformatic analysis in the present study.

Pig;Toll－like receptor;Bioinformatics analysis

R349.64

A

1005－4847(2010)03－0185－06

2009－12－03

廣東海洋大學(xué)博士啟動基金(編號:0712107)。

巨向紅(1977－)，男，研究方向:動物生殖生理與免疫。E－mail:juxianghong@yahoo.com.cn;徐漢進(1982－)，男，研究方向:動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E－mail:pixingdy@hotmail.com，與第一作者有同等貢獻。

雍艷紅。Yongyanhong－007@163.com