孫惠惠，鄧 巍，占玲俊，許黎黎，李楓棣，呂 琦，朱 華，劉 穎，馬春梅，鮑琳琳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

研究報(bào)告

板藍(lán)根顆粒對甲型流感病毒小鼠的作用

孫惠惠，鄧 巍，占玲俊，許黎黎，李楓棣，呂 琦，朱 華，劉 穎，馬春梅，鮑琳琳

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的測定板藍(lán)根顆?？沽鞲胁《镜乃幮ё饔?。方法A/California/7/2009(CA7)病毒滴鼻感染BALB/c小鼠觀察14 d，觀察板藍(lán)根對甲型H1N1流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用，計(jì)算小鼠存活率、存活天數(shù)以及延長生命率。感染的小鼠第5天每組小鼠處死一半，取肺組織，觀察板藍(lán)根對甲型H1N1流感病毒感染小鼠肺組織的保護(hù)作用。結(jié)果板藍(lán)根可明顯延長甲型H1N1流感病毒感染小鼠的存活天數(shù)并提高存活率，病理結(jié)果顯示板藍(lán)根對甲型H1N1流感病毒感染的小鼠的肺組織有一定程度的保護(hù)作用，與模型組比較差異顯著(P＜0.05)。結(jié)論板藍(lán)根顆粒對甲型H1N1流感病毒感染的小鼠有較好的保護(hù)作用。

小鼠;板藍(lán)根顆粒;甲型流感病毒;保護(hù)作用

流行性感冒(簡稱流感)是由流感病毒引起的一種傳染性極強(qiáng)的呼吸道病毒感染性疾病，在呼吸系統(tǒng)中發(fā)病率占首位，我國是流感高發(fā)地區(qū)［1］。流感臨床上有頭痛、高熱、乏力、疲勞、全身肌肉酸痛、咳嗽、咽喉腫痛、鼻塞流涕、腹瀉等一系列癥狀，流感的兩個(gè)重要特征是流行性暴發(fā)和高的病死率［2］，到目前為止前為止還沒有有效防治流感的方法［3］，因此流感的防治刻不容緩。

目前，抗甲型H1N1流感病毒的有效藥物為達(dá)菲，達(dá)菲價(jià)格高，國內(nèi)儲備量少，發(fā)達(dá)國家出現(xiàn)了達(dá)菲耐藥現(xiàn)象，中國多次發(fā)生流感，傳統(tǒng)中醫(yī)藥方法取得了良好的治療效果。板藍(lán)根含有多種氨基酸、谷甾醇、靛青、靛玉紅等多種藥用成分，具有清熱解毒、涼血化斑之功效，對多種細(xì)菌性、病毒性疾病如流感、流腦、腮腺炎、鈞端螺旋體病、肺炎、肝炎等有良好的預(yù)防和治療效果。根據(jù)板藍(lán)根的這些功效，我們以甲型H1N1流感病毒感染小鼠作為藥物評價(jià)模型，通過感染小鼠存活率、存活天數(shù)、肺病理變化來評價(jià)板藍(lán)根對甲型流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 材料

板藍(lán)根顆粒，3 g/袋，批號:8111525，由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn)。陽性對照品為達(dá)菲，批號:090121，規(guī)格:75 mg，由上海羅氏制藥有限公司提供。RVC－Ⅱ型獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具TENCNIPLAST公司。A(H1N1)2009病毒株為A/ California/7/2009(CA7)。經(jīng) 無 特 殊 病 原 體(specific－pathogen free，SPF)雞胚增殖后收集病毒尿囊液，測定TCID50為107。－80℃ 儲存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)均在生物安全Ⅲ級實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。SPF級雌性 BALB/c小鼠，4～6周齡(體重18～20 g)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供［SCXK(京)2006－0009］。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)在本所的BSL－3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，將80只4～6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、達(dá)菲組、板藍(lán)根組4組，每組20只，每組10只用于觀察受試藥物對甲型 H1N1流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用，另10只用于觀察受試藥物對甲型H1N1流感病毒攻毒后小鼠肺組織炎癥改善作用。

1.2.2 鼠的感染性:將小鼠乙醚吸入麻醉后，106TCID50病毒液通過滴鼻途徑感染小鼠，每只小鼠的接種劑量為50 μL，建立甲型流感病毒小鼠模型，對照組小鼠經(jīng)鼻腔滴入等量的生理鹽水。通過小鼠肺組織的 PCR、肺組織病理結(jié)果可證實(shí)甲型H1N1病毒小鼠模型的成功建立［4］。

1.2.2 給藥:板藍(lán)根組的給藥量為4.67 g/(kg·d) (參照臨床劑量)，達(dá)菲組的給藥量為0.03 g/(kg· d)。板藍(lán)根組攻毒2 h后灌胃給藥200 μL、達(dá)菲組攻毒2 h后灌胃給藥200 μL，正常對照組及模型組灌胃給予生理鹽水200 μL，每日1次，連續(xù)用藥5 d。

1.2.3 觀察指標(biāo):用于觀察板藍(lán)根對感染小鼠肺組織的保護(hù)作用的小鼠共觀察14 d，記錄小鼠的死亡數(shù)及生存天數(shù)，并計(jì)算存活率及延長生命率。用于觀察板藍(lán)根對甲型H1N1流感病毒感染小鼠死亡的保護(hù)作用的小鼠在第5天安樂，取肺組織留做病理檢查［5］。

1.2.4 病理學(xué)檢查:無菌取小鼠的肺，福爾馬林溶液中固定24 h，脫水，石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下(Nikon顯微鏡，日本)下觀察其病理變化。1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法:數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS13.0軟件完成，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 板藍(lán)根顆粒對甲型H1N1流感病毒感染小鼠存活率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，板藍(lán)根可明顯降低甲型H1N1流感病毒感染小鼠的死亡率，與模型組比較差異顯著(P＜0.05)，提示板藍(lán)根對甲型H1N1流感病毒感染的小鼠有保護(hù)作用(表1)。

2.2 板藍(lán)根顆粒對甲型H1N1流感病毒感染小鼠平均生存天數(shù)及延長生命率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，板藍(lán)根可明顯可延長小鼠的存活天數(shù)，與模型組比較差異顯著，提示板藍(lán)根甲型H1N1流感病毒感染的小鼠有保護(hù)作用(表2)。

表1 對甲型H1N1流感病毒感染小鼠死亡存活率的影響(n=10)Tab.1 Effect of survival rate of mice challenged with CA7 virus(n=10)

表2 對甲型流感病毒感染小鼠平均生存天數(shù)及延長生命率的影響(±s，n=10)Tab.2 Effect of survival days of mice challenged with CA7 virus(±s，n=10)

表2 對甲型流感病毒感染小鼠平均生存天數(shù)及延長生命率的影響(±s，n=10)Tab.2 Effect of survival days of mice challenged with CA7 virus(±s，n=10)

注:與模型組比較:*P＜0.05，**P＜0.01;▽:本次實(shí)驗(yàn)小鼠觀察周期為14 d。Note:*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.▽:The observation period lasts for 14 days.

組別Group 劑量Dose g/(kg·d) 平均生存天數(shù)Survival days延長生命率(%) Increase in life span(%)空白對照(Control) 等量生理鹽水(NS) 4.67 14±0▽模型對照(Model) 等量生理鹽水(NS) 6.0±1.5 －達(dá)菲(Oseltamivir) 0.03 9.8±3.7**64.41**板藍(lán)根(Banlangen) 4.67 8.0±3.4*25.0*

2.3 病理學(xué)檢查

空白對照組動物(10例/10例)肺臟均未見明顯病理改變。陽性對照(模型)組動物感染甲型H1N1病毒第5天后(10例/10例)肺臟呈彌漫性肺炎改變，主要表現(xiàn)為肺血管擴(kuò)張充血，血管周圍水腫、炎細(xì)胞滲出，肺泡間隔彌漫性炎細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，部分肺泡腔內(nèi)可見滲出的炎細(xì)胞和漏出的水腫液。與臨床報(bào)道的甲型H1N1流感的尸檢病人的肺臟病理改變相似［6］。陽性藥(達(dá)菲)組部分動物(4例/10例)肺臟病變范圍較模型組小，病變程度與模型組基本一致，其余動物(6例/10例)與模型組病變范圍與程度基本一致。板藍(lán)根顆粒組部分動物(2例/10例)肺臟病變范圍較模型組小，病變程度與模型組基本一致(圖1，見彩插6)，但其數(shù)量較陽性藥(達(dá)菲)組少，其余動物(8例/10例)與模型組病變范圍與程度基本一致。具體病變范圍結(jié)果見表3。

表3 甲型H1N1流感病毒感染各組小鼠后肺臟炎癥面積的比較Tab.3 Comparison of lung inflammation proportion of mice challenged with CA7 virus

3 討論

通過長期的研究和探索，中醫(yī)藥治療病毒性疾病已取得了很大進(jìn)展［7－10］。歷史上幾次流感的大流行中，中藥顯示出良好的防治作用。在以往的流感中，板藍(lán)根都有較好的預(yù)防和治療作用，但在甲型H1N1流感的治療方面的作用并不明確，我們建立甲型H1N1流感小鼠模型［4］來評價(jià)板藍(lán)根對甲型流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用，為臨床提供一定的數(shù)據(jù)支持。本次實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M的小鼠肺臟呈彌漫性肺炎改變，主要表現(xiàn)為肺血管擴(kuò)張充血，血管周圍水腫、炎細(xì)胞滲出，肺泡間隔彌漫性炎細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，部分肺泡腔內(nèi)可見滲出的炎細(xì)胞和漏出的水腫液，臨床所見的甲流患者肺臟可見肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、淤血，間隔增寬，肺泡腔內(nèi)可見透明膜形成，肺泡強(qiáng)含氣量減少。

本次實(shí)驗(yàn)病理結(jié)果顯示，感染了甲型 H1N1流感的小鼠第5天后肺臟病理改變與臨床報(bào)道的甲型H1N1流感的尸檢病人的肺臟病理改變相似［6］，而板藍(lán)根組肺臟病變范圍較模型組小。板藍(lán)根組可明顯延長甲型H1N1病毒感染小鼠的存活天數(shù)，提高存活率，與模型組比較差異顯著(P＜0.05)，提示板藍(lán)根顆粒對甲型H1N1病毒感染所致肺部病變具有減輕作用。

中藥抗病毒機(jī)制主要有兩個(gè)方面:一是直接殺傷病毒作用:二是通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫作用間接發(fā)揮抗病毒作用。由于板藍(lán)根具有抗病毒清熱解毒藥，毒副作用很小，流感時(shí)服用板藍(lán)根，可以一定程度上加強(qiáng)自身的免疫力和抗病毒能力。而當(dāng)人體免疫力各方面處于良好的狀態(tài)的時(shí)候，其對預(yù)防和治療病毒也會比一般身體虛弱的人強(qiáng)。板藍(lán)根是一種復(fù)方制劑，其成分多樣，抗甲流病毒的機(jī)制我們正在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中。

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Effect of Banlangen Granule on Mice Challenged with A/California/7/2009

SUN Hui－h(huán)ui，DENG Wei，ZHAN Ling－jun，XU Li－li，LI Feng－di，LV Qi，ZHU Hua，LIU Ying，MA Chun－mei，BAO Lin－lin
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Key Laboratory of Human Diseases Animal Model，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of Banlangen granule against influenza A virus. Methods The mice were inoculated intranasally with 50 μL of 106TCID50influenza A/California/7/2009 Virus，and Banlangen granule was administrated intragastricly 2 hours postinoculation for 5 days.The survival rate and days of mice were calculated at 14 days post infection.Meanwhile the pathological changes were observed。ResultsBanlangen granule could prolong the survival days and reduce the mortality significantly compared with the model group.Banlangen granule could also lessen the pathological change in the lung tissues of challenged mice。ConclusionBanlangen granule has protective effect on A(H1N1)Influenza virus.

Mice;Banlangen granule;A(H1N1)influenza virus;Protection effect

R373.1

A

1671－7856(2010)07－0053－04

2010－04－09

科技重大專項(xiàng)－艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治:2009ZX10004－402;衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項(xiàng)項(xiàng)目:200802036;中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi):DWS200810;Z09000700090904。

孫惠惠(1983－)，女，碩士生，從事實(shí)驗(yàn)動物病毒分子生物學(xué)研究工作。

鮑琳琳(1979－)，女，助研，研究方向:病毒學(xué)。E－mail:bllmsl@yahoo.com.cn