包晶瑩，林飛燕，王一龍，黃卡特，朱加銀，林婷婷，吳 軍，方周溪，吳步猛

(1.溫州醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，溫州 325035;2.溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫州 325035; 3.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科，溫州 325000;4.溫州醫(yī)學(xué)院電鏡室，溫州 325035)

研究報(bào)告

冷拘束應(yīng)激對(duì)大鼠心臟和肝臟HSP70表達(dá)及血清中CK、ALT含量的影響

包晶瑩1，林飛燕1，王一龍2，黃卡特3，朱加銀2，林婷婷1，吳 軍1，方周溪4，吳步猛2

(1.溫州醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，溫州 325035;2.溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫州 325035; 3.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科，溫州 325000;4.溫州醫(yī)學(xué)院電鏡室，溫州 325035)

目的通過(guò)研究冷拘束應(yīng)激中大鼠心臟和肝臟組織熱休克蛋白(HSP70)表達(dá)量以及血清中肌酸激酶(CK)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量的變化，探討冷拘束應(yīng)激對(duì)心臟和肝臟的影響和差異。方法選取50日齡清潔級(jí)大鼠77只，隨機(jī)分為7組，即0 h，0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h，3.0 h。采用拘束冷應(yīng)激法，應(yīng)激相應(yīng)時(shí)間后，用免疫組織化學(xué)方法觀察大鼠心臟和肝臟組織 HSP70的表達(dá)，并檢測(cè)血清中CK和ALT含量。結(jié)果(1)心臟中HSP70表達(dá)量隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，1.5 h組較0 h組有明顯的增加(P＜0.05)，而2.0 h后有極明顯的增加(P＜0.01)。(2)肝臟中HSP70表達(dá)量隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)呈緩慢增加，僅3.0 h組有較明顯的增加，與0 h組、0.5 h組及1.0 h組比較有顯著差異(P＜0.05)。(3)應(yīng)激開(kāi)始階段大鼠血清中的CK含量迅速上升，之后平緩升高;大鼠血清中的ALT含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，2.5 h以前上升較平緩，2.5 h以后急驟升高。結(jié)論冷拘束應(yīng)激可使大鼠心臟中HSP70的表達(dá)量和血清中CK含量在較短的時(shí)間內(nèi)顯著上升，且隨著時(shí)間的增加而遞增，而肝臟中HSP70的表達(dá)量和血清中ALT含量在較短的時(shí)間內(nèi)無(wú)明顯變化，只有在3.0 h時(shí)才顯著增加，提示心臟對(duì)冷拘束應(yīng)激較敏感，而肝臟對(duì)冷拘束應(yīng)激有較強(qiáng)的耐受性。

冷拘束應(yīng)激;心臟;肝臟;熱休克蛋白;肌酸激酶;谷丙轉(zhuǎn)氨酶

冷應(yīng)激是低溫作業(yè)、突發(fā)自然災(zāi)害、軍事作業(yè)等寒冷環(huán)境中不可避免的一種應(yīng)激因素，對(duì)人機(jī)體可產(chǎn)生嚴(yán)重的損害，冷應(yīng)激發(fā)生的機(jī)制幾乎涉及所有的器官和系統(tǒng)，嚴(yán)重者可造成動(dòng)物器官損傷，如胃潰瘍、免疫功能下降等病理現(xiàn)象，進(jìn)而危及生命。鑒于人體對(duì)寒冷的適應(yīng)能力不如適應(yīng)高溫的能力強(qiáng)［1］，寒冷損傷和適應(yīng)歷來(lái)受到醫(yī)學(xué)界高度重視，特別是軍事醫(yī)學(xué)、營(yíng)養(yǎng)醫(yī)學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)對(duì)其研究愈來(lái)愈深入。但是目前對(duì)于冷應(yīng)激對(duì)動(dòng)物臟器組織的損傷差異和變化的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告較少，尤其是急性冷應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)。肌酸激酶(CK)是心肌細(xì)胞的損傷的主要臨床依據(jù)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)對(duì)于肝臟損傷的評(píng)價(jià)具有重要意義。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在熱暴露、冷暴露和損傷等應(yīng)激條件下，一組應(yīng)激蛋白熱休克蛋白家族(heat shock proteins，HSPs)的表達(dá)水平會(huì)顯著增加，HSPs在機(jī)體內(nèi)作為一種分子伴侶而對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用［2，3］，在一定程度上可以作為應(yīng)激的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究在急性冷拘束應(yīng)激條件下大鼠血清中CK和ALT含量以及心臟和肝臟中HSP70表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化來(lái)評(píng)價(jià)冷拘束應(yīng)激對(duì)心臟和肝臟的影響和差異，同時(shí)對(duì)HSP70作為評(píng)價(jià)急性冷應(yīng)激標(biāo)準(zhǔn)的可能性提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague Dawley(SD)大鼠，雄性，77只，清潔級(jí)，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK(浙)2005－0019］，體重180～230 g。

1.2 冷拘束應(yīng)激模型制作

SD大鼠正常喂養(yǎng)50 d后，隨機(jī)分為7組，即分別冷拘束應(yīng)激0 h，0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h和3.0 h，每組11只。實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食24 h，自由飲水，將大鼠四肢束縛于網(wǎng)格板上，限制其活動(dòng)，置于5℃ ±1℃冰箱內(nèi)急性冷應(yīng)激相應(yīng)時(shí)間后取出。

1.3 標(biāo)本制作

將蘸有乙醚的棉球懸掛于乙醚罐中，讓其揮發(fā)，然后將冷拘束應(yīng)激后的大鼠投入容器內(nèi)，約1 min左右即可麻醉，麻醉后應(yīng)立即取出，并準(zhǔn)備一個(gè)裝著蘸有乙醚的棉球小燒杯，在大鼠麻醚變淺時(shí)給套在鼻上使其補(bǔ)吸麻藥。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作人員佩戴口罩和戴橡膠手套，防止乙醚的吸入以及對(duì)皮膚的損傷。每組隨機(jī)各取8只開(kāi)腹，腹主動(dòng)脈取血、分離血清備用，另每組各取3只開(kāi)腹快速取其心臟和肝臟組織各2塊，每塊體積約0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，置于10%中性福爾馬林中固定 24 h以上，水洗、常規(guī)脫水、石蠟包埋，連續(xù)切片5 μm備用。乙醚的麻醉的作用機(jī)制主要是抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，使肌肉松馳，本實(shí)驗(yàn)麻醉時(shí)間較短，并且麻醉后立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)心臟和肝臟的影響較少。

1.4 肌酸激酶及谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量的檢測(cè)

采用化學(xué)比色法測(cè)定CK和賴氏法測(cè)定ALT，試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 HSP70檢測(cè)

免疫組化二步法試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司。石蠟切片脫蠟水化，新鮮配制的 3% H2O2，室溫下孵育10 min去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，0.01 nmol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)抗原熱修復(fù)，滴加兔多克隆抗體 HSP70，稀釋度1∶100，4℃冰箱過(guò)夜;PBS洗 2 min×3次，加二抗山羊抗兔 IgG，37℃溫箱孵育30 min。PBS洗2 min×3次，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，返藍(lán)，脫水，透明，封片。實(shí)驗(yàn)以0 h組作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核染成黃色或棕褐色為陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 數(shù)據(jù)采集

每張切片隨機(jī)選取 10個(gè)觀察區(qū)，采用 Image－Pro Plust5.1圖像處理與分析系統(tǒng)分析免疫組化染色圖像，根據(jù)HSP70陽(yáng)性反應(yīng)區(qū)域的面積代表每一張圖片HSP70陽(yáng)性表達(dá)量。其中心臟和肝臟分別選取8張和10張圖片進(jìn)行計(jì)算。

1.7 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 心臟和肝臟中HSP70表達(dá)的光鏡觀察

由圖1(見(jiàn)彩插5)可以觀察，HSP70主要表達(dá)在心肌間質(zhì)的小動(dòng)脈和小靜脈管壁上，隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)的血管數(shù)量和強(qiáng)度增強(qiáng);0 h組幾乎無(wú)表達(dá);0.5 h組和1.5 h組略有增強(qiáng);1.5 h后增強(qiáng)較顯著，以3.0 h組表達(dá)最強(qiáng)。光鏡觀察，肝臟組織中HSP70主要表達(dá)于匯管區(qū)小葉間動(dòng)脈和小葉間靜脈管壁，隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增強(qiáng);0 h到1.0 h組表達(dá)較少，且無(wú)明顯變化;在1.5 h時(shí)表達(dá)略有增強(qiáng);1.5 h后逐漸增加，到3.0 h時(shí)增強(qiáng)明顯。

2.2 心臟和肝臟組織中HSP70表達(dá)量的變化

心臟中 HSP70表達(dá)量隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，1.5 h組、2.0 h組、2.5 h組及3.0 h組與0 h組有極明顯的增加(P＜0.01);3.0 h組的 HSP70表達(dá)量與0.5 h組和1.0 h組比較也有明顯的增加(P＜0.01)。肝臟中HSP70表達(dá)量隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)呈緩慢增加，在0 h組至2.5 h組間均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但3.0 h組HSP70表達(dá)量有較明顯的增加，與0 h組有極明顯的增加(P＜0.01)，與0.5 h組及1.0 h組比較有顯著差異(P＜0.05)(表1)。

2.3 血清中CK和ALT含量變化

應(yīng)激開(kāi)始階段大鼠血清中的 CK含量迅速上升，之后平緩升高。各實(shí)驗(yàn)組與0 h組比較都有極顯著的升高(P＜0.01);0.5 h組與1.0 h組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，但與其余各組相比較都存在極明顯的差異(P＜0.01)。隨著冷應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠血清中的ALT含量呈上升趨勢(shì)，2.5 h以后急驟升高。3.0 h組與0 h組比較存在極顯著的差異(P＜0.01);其他組與0 h組相比不存在顯著性差異(P＞0.05);0.5 h組、1.0 h組和1.5 h組與3.0 h組相比存在顯著性差異(P＜0.05)(表2)。

表1 各組大鼠心臟和肝臟組織HSP70表達(dá)量的變化(n=3)Tab.1 Changes of HSP70 expression in heart and liver tissues from each group(n=3)

表2 各組血清中CK，ALT活力的比較(n=8)Tab.2 Activity of CK、ALT on serum from each group(n=8)

3 討論

應(yīng)激反應(yīng)是生物體對(duì)趨于打亂其自穩(wěn)狀態(tài)的各種不良刺激的生物反應(yīng)的總和，此代償反應(yīng)不足或不適當(dāng)就會(huì)造成生物穩(wěn)態(tài)的破壞。CK是細(xì)胞內(nèi)酶，廣泛分布于脊椎動(dòng)物組織中，尤以骨骼肌、心肌等組織含量最高;應(yīng)激可致細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞破壞，CK滲漏至細(xì)胞外，使血清中CK含量增高，因此血清CK含量可以作為應(yīng)激時(shí)心肌組織損傷的判定指標(biāo)之一［4］。ALT分布于肝組織中，正常情況下由于細(xì)胞膜的屏障作用不易溢出，僅由于細(xì)胞的不斷更新而少量釋放到血中［5］;只有當(dāng)細(xì)胞受到損傷，細(xì)胞膜的通透性升高，血清中的 ALT含量才會(huì)升高，所以血清中 ALT的含量是判斷肝功能損傷的重要指標(biāo)。HSP70幾乎在所有生物的應(yīng)激細(xì)胞中都經(jīng)常高度地被誘導(dǎo)表達(dá)，HSP70賦予細(xì)胞或生物體從應(yīng)激狀態(tài)中恢復(fù)的能力，并保護(hù)它們免受應(yīng)激的損害，是對(duì)環(huán)境和代謝應(yīng)激綜合反應(yīng)的代表［6］。在一定程度上可以作為評(píng)價(jià)應(yīng)激損傷的指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，血清中CK和ALT的濃度則隨著拘束冷應(yīng)激時(shí)間的增加而遞增，提示大鼠心肌和肝組織可能造成損傷。程樹(shù)軍等［7］發(fā)現(xiàn)溶血可使恒河猴和 Beagle犬血漿中 CK、ALT等酶產(chǎn)生顯著影響并隨著溶血加重而升高，實(shí)驗(yàn)中偶見(jiàn)溶血現(xiàn)象，可能會(huì)對(duì)血清生化指標(biāo)的測(cè)定產(chǎn)生一定的影響。

張北奇等［8］發(fā)現(xiàn)心肌組織對(duì)熱休克、缺血等外源性應(yīng)激刺激呈高敏感性，且隨刺激形式的不同而產(chǎn)生的熱休克蛋白含量也不同。本研究顯示，在冷拘束應(yīng)激初期心臟中 HSP70的表達(dá)量略有上升，1.5 h以后顯著增加，3.0 h時(shí)心臟中 HSP70的表達(dá)量較應(yīng)激初期有明顯的增加。應(yīng)激初期 HSP70表達(dá)量增加不明顯，這可能與HSP70的合成動(dòng)力學(xué)有關(guān)，即沒(méi)有達(dá)到合成高峰。1.5 h以后心臟中HSP70表達(dá)量顯著增加，提示此時(shí)冷應(yīng)激對(duì)心臟產(chǎn)生了一定的損傷，誘導(dǎo)心臟組織產(chǎn)生大量的 HSP70。本研究還顯示，在冷應(yīng)激開(kāi)始階段大鼠血清中的 CK含量迅速上升，之后平緩升高，3 h時(shí)達(dá)到最高值，證實(shí)冷拘束應(yīng)激在較短的時(shí)間內(nèi)就能對(duì)心臟產(chǎn)生一定程度的損傷，且隨著應(yīng)激的持續(xù)損傷有加劇的趨勢(shì)。心臟中HSP70的表達(dá)以及CK含量的變化都提示心臟對(duì)冷拘束應(yīng)激具有較高的敏感性。

李鵬等［9］發(fā)現(xiàn)短時(shí)間的寒冷刺激并不能使肝臟的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。本研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中HSP70表達(dá)量隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)呈緩慢增加，只有在3.0 h時(shí) HSP70表達(dá)量較應(yīng)激初期有明顯的增加，提示短時(shí)間的急性冷應(yīng)激對(duì)肝臟的影響并不很大，但是應(yīng)激3.0 h后也有一定的損傷。本研究對(duì)大鼠血清中ALT含量的動(dòng)態(tài)觀察也顯示只有3.0 h時(shí)有顯著地升高，提示肝臟對(duì)拘束冷應(yīng)激的反應(yīng)較遲鈍，但持續(xù)的拘束冷應(yīng)激也可能對(duì)肝組織造成損傷。肝臟中HSP70的表達(dá)和ALT含量的變化都提示肝臟對(duì)拘束冷應(yīng)激具有較強(qiáng)的耐受性。

綜上所述，冷拘束應(yīng)激可使大鼠心臟中HSP70的表達(dá)量和血清中CK含量在較短的時(shí)間內(nèi)顯著上升，且隨著時(shí)間的增加而遞增，而肝臟中 HSP70的表達(dá)量和血清中 ALT含量在較短的時(shí)間內(nèi)無(wú)明顯變化，只有在3.0 h時(shí)才顯著增加，提示心臟對(duì)冷拘束應(yīng)激較敏感，而肝臟對(duì)冷拘束應(yīng)激有較強(qiáng)的耐受性。

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The Effect of Cold Restraint Stress on the Expression of Heat Shock Protein in Heart and Liver and the Levels of CK，ALT from Serum in Rats

BAO Jing－ying1，LIN Fei－yan1，WANG Yi－long2，HUANG Ka－te3，ZHU Jia－yin1，LIN Ting－ting1，WU Jun1，F(xiàn)ANG Zhou－xi4，WU Bu－meng2
(1.School of Life Sciences，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China; 2.Laboratory Animal Science Center，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China; 3.Department of Pathology of the First Affialiated Hospital affiliated to Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China; 4.Electron Microscope Room，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China)

ObjectiveTo explore the effect of cold restraint stress on heart and liver of rats，the expression of HSP70 and the levels of CK and ALT in serum was studied。Methods77 SD rats of 50 days old were randomly divided into 7 groups，namely 0 h，0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h，3.0 h group.The cold－restrained rats lasted thecorresponding time， then the distributionsofHSP70 in heartand livertissues were examined by means of immunohistochemistry method and the level of CK and ALT in serum was determined。Results(1)The HSP70 expression in heart increased with stress time 1.5 h group had an obvious increase compared with the 0 h group(P ＜ 0.05)，and after 2.0 h group，the increase was more significant.(2)The HSP70 expression in liver increased slowly with stress time. Only 3.0 h group had an obvious increase compared with the 0 h，0.5h and 1.0h group(P ＜0.05).(3)The level of CK rose quickly at the beginning stage of the stress，then changed smoothly.The level of ALT in serum rose with stress time，during the first 2.5 h changed smoothly but significantly increased at 2.5 h group。ConclusionThe cold restraint stress could induce the expression of HSP70 in heart and the level of CK in serum markedly increasing in a short time，and increased with stress time，while the expression of HSP70 in liver and the level of ALT in serum had no markedly change in a short time，only after 3 hours the increase became obvious，it suggests that heart is more sensitive to the cold restraint stress，while liver has more powerful resistance.

Cold restraint stress;Heart;Liver;HSP70;CK;ALT

Q494

A

1671－7856(2010)07－0036－04

2010－01－21

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No:Y20060106)，溫州醫(yī)學(xué)院科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目(No:200801052)。

包晶瑩，(1988－)，女，本科，生物科學(xué)專業(yè)。

吳步猛，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科研工作。E－mail:wbm710@wzmc.net