呂 丹,陳 煒,曹興水,張曉娟,王書美,張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

研究報告

神經(jīng)組織特異表達(dá) CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠的建立

呂 丹,陳 煒,曹興水,張曉娟,王書美,張連峰

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實驗動物研究所,衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室,北京 100021)

目的建立神經(jīng)組織特異表達(dá) CTF1的轉(zhuǎn)基因模型小鼠,為研究 CTF1生物學(xué)功能及與老年癡呆等疾病發(fā)病機制的關(guān)系提供工具動物。方法把 CTF1基因插入神經(jīng)組織特異的啟動子 PDGF下游,構(gòu)建轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體,顯微注射法建立 C57BL/6J CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠基因型,采用Western Blot方法鑒定CTF1在腦組織中的表達(dá),對轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織進(jìn)行石蠟切片,HE染色,顯微鏡觀察組織結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變。結(jié)果建立了 2個不同表達(dá)水平的 CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠品系。轉(zhuǎn)入的 CTF1基因在腦組織的表達(dá)水平均高于同齡對照小鼠。組織學(xué)分析顯示 CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠大小腦組織基本結(jié)構(gòu)形態(tài)未見異常。結(jié)論成功建立了穩(wěn)定遺傳的神經(jīng)組織特異表達(dá)CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠品系,為 CTF1的生物學(xué)功能及與老年癡呆等疾病發(fā)病機制關(guān)系的研究提供了有力的模型工具。

心肌營養(yǎng)素-1;神經(jīng)組織;轉(zhuǎn)基因

1995年 Pennica等[1]從小鼠心臟分離的胚胎干 細(xì)胞中克隆出一種細(xì)胞因子 -心肌營養(yǎng)素-1(Cardiotrophin 1,CTF1)。序列同源性比較及結(jié)構(gòu)分析表明,CTF1屬于白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6, I

L-6)細(xì)胞因子家族。CTF1存在于多種組織中,是一種具有廣譜生物學(xué)活性的細(xì)胞因子,具有心肌肥大及心肌細(xì)胞保護(hù)作用,同時其作為一種多效性細(xì)胞因子對包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的其他組織皆產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)影響。

人 CTF1基因位于染色體 16p11.1～p11.2[2]。人 CTF1 mRNA長 1539 bp,編碼 201個氨基酸組成的蛋白質(zhì),相對分子質(zhì)量為 26 700,全長 CTF1蛋白沒有N端分泌信號肽的疏水性序列及糖基化位點,只有小鼠 CTF1含有一個N端潛在糖基化位點。人和大鼠 CTF1氨基酸序列的同源性為 81%,人與小鼠為 79%。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析[1,2],CTF1屬于白細(xì)胞介素-6( IL-6)/白細(xì)胞介素-11( IL-11)/睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子 (Ciliary neurotrophic factor,CNTF)/抑瘤素 M(Oncostatin,OS M)/白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,L IF)細(xì)胞因子家族,該家族成員在氨基酸Ⅰ級結(jié)構(gòu)上有較低的同源性,但它們在Ⅲ級結(jié)構(gòu)上都具有 4個α螺旋組成的螺旋束,同時該家族都通過 gpl30同源二聚體或 gpl30/ L IF受體β(L IF receptorβ,L IFRβ)異源二聚體的形成進(jìn)行信號傳遞,有類似的生物學(xué)活性。CTF1作為I

L-6細(xì)胞因子超家族的一員,它們以糖蛋白鏈細(xì)胞因子受體亞單位 gpl30作為共同的受體和轉(zhuǎn)導(dǎo)子, CTF1的第二個受體:白血病抑制因子受體亞單位β (L IFRβ),即 gpl90。此外,CTF1還有第三個受體,是相對分子質(zhì)量 80×103的 CTF1特異受體,類似于CNTF受體成分中的α亞基,其可能與 gpl30和gpl90形成三聚體[3]。CTF1和特異的受體結(jié)合后,誘導(dǎo) gpl30同源二聚體或異源二聚體的形成,從而激活與之結(jié)合的胞漿內(nèi)的酪氨酸激酶,激活 Janus激酶(JAKs)和 gpl30酪氨酸激酶磷酸化,導(dǎo)致多個信號通路的激活[4]。目前已發(fā)現(xiàn) CT-1細(xì)胞內(nèi)信號通路包括 JAK/STAT3,MAPK/ERK和 PI3-K/Akt,其下游介質(zhì)有多聚 ERK配對轉(zhuǎn)錄因子、核因子-3、STAT3和熱休克蛋白 (HSP)56、70、90等[5]。

作為一種多效性細(xì)胞因子,CTF1在神經(jīng)系統(tǒng)具有類似于其它神經(jīng)營養(yǎng)因子的生物學(xué)作用。CTF1能維持運動神經(jīng)元、多巴胺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元長時間存活,誘導(dǎo)培養(yǎng)交感神經(jīng)元遞質(zhì)表型的連接[6-8]。而 CNTF僅能保護(hù)交感神經(jīng)元,并不能誘導(dǎo)產(chǎn)生對多巴胺能神經(jīng)存活的生物學(xué)效應(yīng),因此CTF1較 IL-6家族其他成員具有更強的神經(jīng)系統(tǒng)作用。除了對不同神經(jīng)元的保護(hù)效應(yīng)外,CTF1還能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的交感神經(jīng)元的顯性轉(zhuǎn)換。這將導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶及血管活性肽的膽堿能顯性,同時伴有類似于酪氨酸過氧化物酶的兒茶酚胺酶的遺失[9]。此外,大腦發(fā)育過程中星形細(xì)胞的分化是通過 CTF1誘導(dǎo)的信號與骨形成蛋白之間的互作來實現(xiàn)的[10]。

鑒于 CTF1在神經(jīng)系統(tǒng)上的研究日益增多,其對神經(jīng)系統(tǒng)的影響及其與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病的關(guān)系逐漸被人們所重視。本研究經(jīng) CTF1基因插入PDGF B-鏈啟動子下游,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將 CTF1基因轉(zhuǎn)入 C57BL/6J小鼠,建立了神經(jīng)組織特異表達(dá)CTF1的轉(zhuǎn)基因小鼠,并對轉(zhuǎn)基因小鼠的腦組織進(jìn)行組織學(xué)觀察分析,為 CTF1在神經(jīng)系統(tǒng)的生物學(xué)功能研究,以及 CTF1對老年癡呆及帕金森等神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機制的研究提供有價值的模型動物。

1 材料和方法

1.1 CTF1表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因

以 pCMV-SPORT6-CTF1質(zhì) 粒 (Openbiosy ster ms,Clone ID5750481,美國)為模板,通過 PCR擴增獲得帶有 HindⅢ和 XholⅠ酶切位點的完整的CTF1基 因 (BC064416),上 游 引 物 為:5′-TATAAGCTTCACCATGAGCCGGAGGGAG-3′;下游引物為:5′-AAACTCGAGCAAAGAAGCGGAAGGAGAG ACG-3′(上海生物工程技術(shù)有限公司合成,中國)。將 CTF1片段插入 pMD18T載體,經(jīng)測序并比對正確無突變堿基后,以 HindⅢ和 XholⅠ(寶生物工程有限公司,中國)酶切回收該片段,并克隆入 PDGF B-鏈啟動子(TuckerCollins博士惠贈,哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院)的下游構(gòu)建神經(jīng)組織特異表達(dá) CTF1表達(dá)載體。提取并酶切鑒定質(zhì)粒正確后,再用 Tth111Ⅰ和 XbaⅠ (寶生物工程有限公司,中國)將其線性化, Sephedex G50柱純化DNA片段,獲得 PDGF啟動的CTF1基因的轉(zhuǎn)基因片段,注射前將其濃度調(diào)整至 5 ng/μL,用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中[小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所,康藍(lán)公司。XCXK(京) 2004001],用 I CR小鼠作假孕受體 (本實驗室飼養(yǎng)),制備轉(zhuǎn)基因小鼠 (TE2000U顯微注射儀)[11]。實驗中涉及動物的操作程序已經(jīng)得到中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所實驗動物使用與管理委員會的批準(zhǔn),批準(zhǔn)號為 GC05004。

1.2 PCR鑒定 CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

轉(zhuǎn)基因小鼠在出生 9～14 d用剪趾法標(biāo)記,收集剪下的組織,用堿裂解法提取基因組 DNA[12],用PCR法對轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行基因型檢測。PCR上游引物為:5′-AGCCGGAGGGAGGGAAGTCT-3′,下游引物為:5′-AGAAGCTGGGCAGCCCGAAG-3′(上海生物工程技術(shù)有限公司合成,中國)。PCR反應(yīng)體系20μL(寶生物工程有限公司,中國)。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性 3 min,94℃變性 30 s,65℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s,重復(fù)變性到延伸 29次,完成 30個循環(huán)。目的基因 CTF1片段為 181 bp。

1.3 W estern Blot鑒定 CTF1的表達(dá)

分別提取 2只首建鼠的 F1代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡陰性對照小鼠腦組織總蛋白,進(jìn)行 SDSPAGE凝膠電泳,蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上(Millopore,美國),置于 5%脫脂奶粉封閉液,羊抗 CTF1抗體檢測 CTF1蛋白的表達(dá)水平 (Abcam,美國),辣根過氧化物酶 (HRP)-偶聯(lián)的兔抗羊抗體結(jié)合一抗 (Pierce,美國),HRP-偶聯(lián)的鼠抗β-actin單克隆抗體作為內(nèi)參(康成生物,中國)。

1.4 組織學(xué)觀察 CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織

選用 1月齡和 4月齡轉(zhuǎn)基因和同齡陰性對照小鼠,頸椎脫臼法犧牲小鼠,打開顱腔取出完整腦組織,中性福爾馬林溶液中固定 24 h,脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,顯微鏡下觀察(Nikon顯微鏡,日本)組織學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 CTF1表達(dá)載體的構(gòu)建

用 PCR法克隆的 CTF1基因,測序結(jié)果表明克隆的 CTF1基因與已報道 CTF1序列完全一致(GenBank:BC064416.1),將該基因插入神經(jīng)組織特異表達(dá)的 PDGF啟動子的下游,構(gòu)建CTF1轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體 (圖 1)。

2.2 CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,轉(zhuǎn)入到假孕受體 I CR小鼠中,小鼠出生 9～14 d提取基因組DNA,用 PCR擴增CTF1目的基因 181 bp的片段來鑒定CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠基因型(圖 2),共得到 2只首建鼠,均可傳代。

2.3 CTF1基因的表達(dá)

分別提取 2個首建鼠的 F1代轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡陰性對照小鼠腦組織總蛋白,用 CTF1多克隆抗體進(jìn)行Western Blot分析,結(jié)果顯示在相對分子量為 21×103處,6號和 12號轉(zhuǎn)基因陽性小鼠品系腦組織內(nèi) CTF1蛋白表達(dá)量明顯高于同齡陰性對照小鼠(圖 3見彩插 4)。

圖 1 CTF1轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體Fig.1 CTF1 transgenic construct

圖 2 PCR分析 CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠基因型Fig.2 Genotyping CTF1 transgenic mice by PCR注:M:DNA分子量標(biāo)記;1:陽性對照;2:陰性對照;3:空白對照;6,7,9:F1代陽性轉(zhuǎn)基因小鼠;4,5,8:F1代陰性轉(zhuǎn)基因小鼠

2.4 CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織學(xué)改變

將 1月齡和 4月齡的 CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠和同齡陰性小鼠的腦組織進(jìn)行解剖和組織結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察,未發(fā)現(xiàn)異常。將腦組織進(jìn)行 H&E染色,鏡下觀察, CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠與同齡陰性對照小鼠相比較,大腦皮質(zhì),深層髓質(zhì),軟膜,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及錐體細(xì)胞等均未見明顯結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變。小腦分子層、蒲肯野細(xì)胞層及顆粒層亦未見明顯結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變 (圖 4見彩插 4)。

3 討論

CTF1屬于 IL-6細(xì)胞因子家族,存在于多種組織中,由于 IL-6細(xì)胞因子家族成員在生物學(xué)作用上具有多樣性和重疊性的特點,決定了 CTF1對多個系統(tǒng)具有廣泛的影響,是一種具有廣譜生物學(xué)活性的細(xì)胞因子,CTF1不僅對心臟產(chǎn)生多種影響[13],在神經(jīng)系統(tǒng)還具有類似于其它神經(jīng)營養(yǎng)因子的生物學(xué)作用。CTF1能維持運動神經(jīng)元,多巴胺神經(jīng)元和交感神經(jīng)元長時間存活,誘導(dǎo)培養(yǎng)交感神經(jīng)元遞質(zhì)[7,8,14],然而 CTF1的神經(jīng)元保護(hù)維持作用的具體機制尚不明確[15]。CTF1是為研究心肌肥大作用而克隆出的細(xì)胞因子,隨后的研究使人們更感興趣的是 CTF1的心肌保護(hù)和神經(jīng)元保護(hù)作用。目前有關(guān)CTF1基因結(jié)構(gòu)、受體組成及 CTF1對不同組織細(xì)胞的生物學(xué)作用的研究已經(jīng)相繼展開。

本文建立的神經(jīng)組織特異表達(dá) CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠,腦組織中 CTF1蛋白表達(dá)明顯高于對照小鼠,轉(zhuǎn)基因小鼠大、小腦組織結(jié)構(gòu)形態(tài)未見明顯改變。未來將本文建立的神經(jīng)組織特異表達(dá) CTF1轉(zhuǎn)基因小鼠與基因突變致早老癡呆轉(zhuǎn)基因小鼠模型雜交,對子代雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型腦組織病理學(xué)改變及相關(guān)機制的研究,有望進(jìn)一步加深 CTF1對神經(jīng)系統(tǒng),如在神經(jīng)元保護(hù)及在神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞等方面的作用機制的理解,同時對臨床上包括老年癡呆,帕金森等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制及治療方面的深入研究皆具有重要意義。

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The Establishment of CTF1 Gene TransgenicM ice Specifically Expressed in Nervous Tissues

LV Dan,CHENGWei,CAO Xing-shui,ZHANG Xiao-juan,WANG Shu-mei,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Disease ComparativeMedicine,Ministry of Heath, Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Sciences& ComparativeMedical Center,PekingUnionMedical College,Beijing 100021,China)

ObjectiveTo generate the CTF1 gene transgenic mice specifically expressed in nervous tissues and to make an animalmodel for the study of its function and effects on Alzheimer’s disease。MethodsTransgenic mice were created by the methods of microinjection.The genotype of transgenic lines was identified by PCR.The brain specific expression of the CTF1 gene was analyzed byWestern Blot.The histological changes of the brain from the transgenic mice were analyzed by microscope observation。ResultsTwo transgenic lines with high level of expression of the CTF1 gene were selected from three transgenic lines.The transgenic mice show no difference compared with wild type by histological detection on brain tissues。Conclusions A CTF1 gene transgenic mice specifically expressed in nervous tissues was established,itwill be an useful animalmodel to study the CTF1 functions on AD.

CTF1;Nervous tissues;Transgene

R349.83

A

1671-7856(2010)01-0028-04

2009-09-09

衛(wèi)生部行業(yè)基金,實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501-026)。

呂丹(1980年 -),女,實習(xí)研究員。E-mail:lvdan0707@163.com

張連峰。E-mail:Zhanglf@cnilas.org