林 薇，趙錦燕，鄭良樸，曹治云，陳旭征，葉蕻芝

(1.福建中醫(yī)學(xué)院福建省高校中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建中醫(yī)學(xué)院)，福州 350108; 2.福建中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350108)

研究報(bào)告

不同濃度血府逐瘀湯含藥血清對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

林 薇1，2，趙錦燕1，2，鄭良樸1，2，曹治云2，陳旭征2，葉蕻芝2

(1.福建中醫(yī)學(xué)院福建省高校中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建中醫(yī)學(xué)院)，福州 350108; 2.福建中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350108)

目的觀察不同濃度血府逐瘀湯含藥血清對(duì)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖、遷移及侵襲的影響，以及其生成一氧化氮(NO)的情況。方法用MTT法觀察VSMCs的增殖，Transwell小室法觀察VSMCs的遷移、侵襲，并檢測(cè)培養(yǎng)上清液一氧化氮(NO)的含量。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，5%血府逐瘀湯組能顯著促進(jìn)VSMCs的增殖(P＜0.05)，20%，30%血府逐瘀湯組能顯著抑制VSMCs的增殖(P＜0.05);與空白對(duì)照組比較，培養(yǎng)48 h的培養(yǎng)上清液中，血府逐瘀湯組的NO水平有顯著升高(P＜0.01)，且與血府逐瘀湯含藥血清的濃度有劑量依賴關(guān)系。結(jié)論低濃度(＜10%)血府逐瘀湯含藥血清有促進(jìn) VASMCs增殖和遷移、侵襲的作用，高濃度(＞10%)血府逐瘀湯含藥血清有抑制VASMCs增殖、遷移和侵襲的作用，其作用可能與上清液的NO水平有關(guān)。

血府逐瘀湯;血管平滑肌細(xì)胞;增殖;遷移;侵襲

血管平滑肌細(xì)胞是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)及維持血管張力的主要細(xì)胞成分，其粘附、鋪展和遷移時(shí)導(dǎo)致血管重建發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其結(jié)構(gòu)及功能的改變是導(dǎo)致高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后在狹窄等多種心血管病的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯既有促血管生成的作用［1］，又能預(yù)防經(jīng)皮血管腔內(nèi)成形術(shù)后再狹窄的作用。筆者通過實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度血府逐瘀湯含藥血清對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響及NO濃度的變化，初步探討其作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物及分組

SD大鼠12只，6周齡，體重150±20 g，雌雄各半，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物批號(hào):0037614，SPF級(jí)，經(jīng)福建中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)［SYXK(閩)2005－0004］，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 藥物制備

血府逐瘀湯中各藥量為:當(dāng)歸9 g，生地黃9 g，桃仁12 g，紅花9 g，枳殼6 g，赤芍6 g，柴胡3 g，甘草6 g，桔梗4.5 g，川芎4.5 g，牛膝9 g，購(gòu)自福建中醫(yī)學(xué)院國(guó)醫(yī)堂藥房。該方水煎2次，煎液過濾，混合后加熱濃縮至含生藥量1.3 g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑及設(shè)備

DMEM高糖培養(yǎng)液、南美胎牛血清、胰蛋白酶－EDTA、磷酸鹽緩沖液 (美國(guó)Hyclone公司);明膠，戊巴比妥鈉(Pentobarbital Sodium)(美國(guó)，SIGMA公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO) (美國(guó)Amresco公司);boyden小室(江蘇省海門市麒麟醫(yī)用儀器廠);培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板 (美國(guó)，Corning公司);一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所);半自動(dòng)生化分析儀(意大利生物技術(shù)公司);超凈工作臺(tái)(江蘇蘇州凈化設(shè)備公司);CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)，Heraeus公司);IX70倒置相差顯微鏡及數(shù)碼攝像裝置(日本，OLYMPUS公司)。

1.4 含藥血清制備

血府逐瘀湯組(XFZYD)分別用中藥6.5 g/kg灌胃，空白對(duì)照組(control)用6.5 g/kg生理鹽水灌胃，每日2次，連續(xù)灌胃7 d，于第7天灌胃2 h后，以3%戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置1 h后，3000 r/min離心15 min分離血清，經(jīng)56℃、30 min滅活后，用0.22 μm過濾除菌，置－20℃保存。

1.5 大鼠血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠平滑肌細(xì)胞(麥莎生物技術(shù)公司)，用含10%FBS的 DMEM高糖培養(yǎng)液，置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.6 MTT實(shí)驗(yàn)

靜止的大鼠血管平滑肌細(xì)胞以1×104個(gè)/mL的密度懸浮于10%FBS DMEM高糖培養(yǎng)液中，接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別用5%、10%、20%、30%的血府逐瘀湯含藥血清和空白對(duì)照血清干預(yù)。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48 h后，加入MTT溶液10 μL(終濃度5 mg/mL)，孵育4 h后棄去上清液，加入100 μL DMSO，振蕩10 min后，于酶標(biāo)儀上570nm檢測(cè)吸光度(A)。

1.7 遷移實(shí)驗(yàn)

靜止的大鼠血管平滑肌細(xì)胞懸浮于無血清DMEM高糖培養(yǎng)液中，培養(yǎng)體系為5%、10%、20%、30%的血府逐瘀湯含藥血清和空白對(duì)照血清。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液將其置于boyden小室的下室，中間置以孔徑8 μm的聚碳酸酯膜，上室加入靜止的大鼠血管平滑肌細(xì)胞2×104個(gè)，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。聚碳酸酯膜上膜的細(xì)胞以棉簽輕輕刮去，下膜以中性甲醛固定，蘇木素常規(guī)染色，400×視野隨機(jī)計(jì)數(shù)6個(gè)視野細(xì)胞數(shù)。

1.8 侵襲實(shí)驗(yàn)

Boyden小室中間置以孔徑8 μm的0.5%明膠包被24 h的聚碳酸酯膜，其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.9 NO含量的檢測(cè)

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說明書進(jìn)行含量測(cè)定。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同濃度血府逐瘀湯對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

與空白對(duì)照組比較，5%、10%血府逐瘀湯含藥血清作用12 h、24 h時(shí)，對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖沒有顯著影響;作用36 h、48 h時(shí)，可顯著促進(jìn)大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖(P＜0.05);20%、30%血府逐瘀湯含藥血清作用12 h、24 h時(shí)，均不能抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖;作用36 h時(shí)，均可抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖(P＜0.05)(表1)。

表1 各組吸光度值的比較(n=8)Tab.1 The absorb value of various groups(n=8)

2.2 不同濃度血府逐瘀湯對(duì)大鼠血管平滑肌細(xì)胞遷移、侵襲的影響

與空白對(duì)照組比較，5%的血府逐瘀湯含藥血清干預(yù)后，遷移、侵襲到下層膜的細(xì)胞數(shù)有顯著升高(P＜0.05);10%的血府逐瘀湯含藥血清干預(yù)后，遷移到下層膜的細(xì)胞數(shù)有顯著升高(P＜0.01)，侵襲到下層膜的細(xì)胞數(shù)無明顯變化;20%、30%的血府逐瘀湯含藥血清干預(yù)后，遷移、侵襲到下層膜的細(xì)胞數(shù)均有顯著升高(P＜0.01)(表2)。

表2 各組遷移、侵襲到下層膜的細(xì)胞數(shù)的比較(n=6)Tab.2 The migration and invasion assay of various groups(n=6)

2.3 血府逐瘀湯對(duì)培養(yǎng)上清液NO的影響

與空白對(duì)照組比較，各濃度的血府逐瘀湯含藥血清培養(yǎng)細(xì)胞48 h的上清液中NO水平都有顯著升高(P＜0.01)，且與血府逐瘀湯含藥血清的濃度有劑量依賴關(guān)系(表3)。

表3 各組培養(yǎng)上清液NO含量的比較(n=6)Tab.3 The NO in supernatant various groups(n=6)

3 討論

血府逐瘀湯出自清代王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》，具有疏肝理氣、活血化瘀功效，原著論述可治20種瘀血之證，是目前在血瘀證應(yīng)用中最具有代表性臨床方劑。血清藥理學(xué)方法被廣泛地應(yīng)用于中藥的藥理學(xué)研究，適合在細(xì)胞、亞細(xì)胞、分子水平對(duì)中藥及中藥復(fù)方進(jìn)行深入的機(jī)制研究［2］。新生內(nèi)膜形成是局部血管損傷的一種過修復(fù)反應(yīng)，在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、冠脈搭橋術(shù)后移植血管及血管成形術(shù)后局部血管的再狹窄等多種損傷性血管疾病的病理過程中均扮演重要角色，眾多血管活性物質(zhì)及生長(zhǎng)因子均參與其復(fù)雜生物學(xué)過程。新生內(nèi)膜形成與血管重塑之間的穩(wěn)態(tài)失衡是導(dǎo)致血管再狹窄的重要因素，從血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管平滑肌細(xì)胞增殖等方面探討新生內(nèi)膜形成和再狹窄的分子機(jī)制已成為目前研究的熱點(diǎn)［3，4］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用血府逐瘀湯含藥血清干預(yù)大鼠血管平滑肌增殖、遷移及侵襲，結(jié)果表明5%血府逐瘀湯含藥血清對(duì)大鼠血管平滑肌增殖、遷移及侵襲有顯著的促進(jìn)作用，20%和30%血府逐瘀湯含藥血清對(duì)其有顯著的抑制作用。研究提示血府逐瘀湯可能是通過抑制血管平滑肌增殖、遷移或者侵襲來抑制血管成形術(shù)后局部血管的再狹窄的發(fā)生，或者抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成;同時(shí)血府逐瘀湯也有可能是通過促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移或者侵襲來參與到新生內(nèi)膜形成，這兩者間平衡調(diào)節(jié)有待于進(jìn)一步的研究。

血管內(nèi)皮損傷所引發(fā)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)粘附、增生及向內(nèi)膜下遷移，其機(jī)制非常復(fù)雜，眾多的細(xì)胞因子參與其中，但迄今尚未明確其作用機(jī)理［5，6］。NO是血管內(nèi)皮分泌的最重要的一種內(nèi)皮源性血管活性因子，在許多血管病變的病理生理過程中起著重要的作用［7］，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。近年發(fā)現(xiàn)它在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)NO的水平是其作用機(jī)制的關(guān)鍵因素，且NO對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有促進(jìn)和抑制的雙向調(diào)節(jié)作用［8］;在調(diào)節(jié)血管SMCs增殖、凋亡、遷移及血管基質(zhì)形成方面也具有重要作用［9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度的大鼠血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中NO的含量有顯著變化，且與血府逐瘀湯含藥血清的濃度有劑量依賴關(guān)系，從而推測(cè) NO濃度可能是其調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵。NO在血管SMCs增殖、凋亡、遷移及血管基質(zhì)形成方面是否也具有促進(jìn)和抑制的雙向調(diào)節(jié)作用以及如何通過 NO水平來發(fā)揮作用有待進(jìn)一步深入研究。

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Effect of Different Concentration of XueFuZhuYu Decoctions on Proliferation，Migration and Invasion of Vascular Smooth Muscle Cells in Rats

LIN Wei1，2，ZHAO Jin－yan1，2，ZHENG Liang－pu1，2，CAO Zhi－yun2，CHEN Xu－zheng2，YE Hong－zhi2
(1.Fujian Academy of Integrative Medicine，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350108，China; 2.Fujian Academy of Integrative Medicine，F(xiàn)uzhou 350108，China)

ObjectiveTo observe effect and nitrogen monoxidum of different concentrations XueFuZhuYu decoction on proliferation，migration and invasion of vascular smooth muscle cells in rats。MethodsMTT assay was used to view proliferation of VSMCs.Cell migration and invasion was determined by Transwell assay，contents of nitrogen monoxidum in supernatant were detected。ResultsCompared with blank group，5%XueFuZhuYu Decoction could promote proliferation，migration and invasion(P＜0.05)，20% and 30% XueFuZhuYu decoction could inhibit proliferation，migration and invasion(P＜0.05).Contents of nitrogen monoxidum in all dose groups were significantly elevated after culturing 48 hours(P＜0.01)。Conclusions Low concentration(＜10%)serum containing XueFuZhuYu decoction could promote proliferation，migration and invasion，high concentration(＞10%)could inhibit proliferation，migration and invasion.The effect was related with contents of nitrogen monoxidum.

XueFuZhuYu decoction;Vascular smooth muscle cells;Proliferation;Migration;Invasion

R－33

A

1671－7856(2010)05－0057－04

2009－12－17

福建省自然基金資助課題(2009J01173)，福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(CKJ2008061)。

林薇(1974－)，女，助理研究員，主要從事生化與免疫的研究。

葉蕻芝(1968－)，女，副研究員。E－mail:yelin0930@163.com