郭亞南，文海泉

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院皮膚科，長沙 410011)

DNCB致敏/激發(fā)Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎模型的建立

郭亞南，文海泉

(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院皮膚科，長沙 410011)

目的 研究外用2，4-二硝基氯苯(DNCB)對Nc/Nga小鼠的致敏作用，探索建立特應(yīng)性皮炎(AD)模型的方法。方法 外用1%DNCB7周，間隔為1周，重復(fù)刺激并致敏7周大NC/Nga小鼠的雙側(cè)耳朵及背部皮膚。結(jié)果 外用DNCB7周可以引起顯著的炎癥，并伴有高滴度的IgE和IL-4，利用HE染色進行組織病理分析，提示表皮炎性細胞明顯增加。結(jié)論 外用DNCB重復(fù)刺激Nc/Nga小鼠能產(chǎn)生AD樣皮炎，可以作為研究AD病因及治療AD的有效動物模型。

特應(yīng)性皮炎;模型，動物;Nc/Nga小鼠

特應(yīng)性皮炎(AD)是常見的皮膚病之一，伴有劇烈瘙癢且易復(fù)發(fā)，對患者生活質(zhì)量影響大。建立合適的動物模型是研究 AD的基礎(chǔ)，國外資料顯示Nc/Nga小鼠可以產(chǎn)生AD樣皮損，血漿內(nèi)IgE、IL-4增高，與人類AD相似。我們采用外用DNCB刺激Nc/Nga小鼠，建立了AD動物模型，以期有助于AD治療新藥的研發(fā)。

1 材料和方法

1.1 動物與試劑

從Charles River Laboratories Japan購得 6周大SPF級Nc/Nga小鼠。實驗開始前放置在空調(diào)房間中1周適應(yīng)環(huán)境，房間溫度保持在23℃±3℃，濕度保持在50% ±0%，照明時間為早8點到晚8點，自由取食。小鼠 IL-4、IgE酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自Invitrogen公司，DNCB購自北京市化學(xué)試劑公司，DNCB溶解于丙酮/橄欖油(1∶3)當中，濃度為1%。

1.2 方法

皮損誘導(dǎo)參考DNCB誘發(fā)Nc/Nga小鼠皮炎的文獻并稍有改進［1］，10只 Nc/Nga小鼠隨機分成2組(n=5)，模型組:小鼠7周齡時用1%的DNCB 20 μL涂抹在小鼠足墊及除毛之后的腹部，1周后用DNCB涂抹在小鼠雙側(cè)耳部及背部，每周1次，共6次。對照組:用丙酮/橄欖油(1∶3)代替DNCB。

1.3 觀察指標

1.3.1 皮損嚴重程度:觀察各組小鼠皮炎情況并拍照，第14周末，用游標卡尺測量小鼠耳部厚度。

1.3.2 小鼠搔抓行為:第14周末，將小鼠單獨放置，觀察10 min內(nèi)小鼠搔抓耳部、背部的次數(shù)，連續(xù)搔抓算作一次。

1.3.3 血清IgE、IL-4的含量:第14周末摘除小鼠眼球，眼眶內(nèi)取血，肝素鈉抗凝血在4℃下3000 r/ min離心30 min，獲取血漿，并保存在 －20℃中，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血漿中細胞因子的濃度。

1.3.4 組織病理:處死小鼠后，耳部皮損組織用10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色后顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料以均數(shù)±標準差表示，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果(圖1～2見彩插2)

2.1 皮損炎性反應(yīng)

我們的試驗表明外用 DNCB第1次刺激 Nc/ Nga小鼠，皮膚無改變，第2次刺激24 h后，可見耳朵出現(xiàn)腫脹，頸背部出現(xiàn)脫毛及抓痕，隨著刺激的增加，小鼠脫毛范圍擴大，并有明顯的糜爛滲血等改變，第7次刺激后，在小鼠頸背部皮膚出現(xiàn)紅斑、滲出、出血和表皮剝脫、脫毛，雙側(cè)耳朵出現(xiàn)明顯腫脹、出血、結(jié)痂;對照組小鼠皮膚無明顯改變(圖1)。

圖1 模型組和對照組小鼠皮損炎性反應(yīng)比較Fig.1 The Ocomparison of skin inflammation between model group(A) and control group(B)

圖2 耳朵HE染色切片（×40）Fig.2 HE stain of ear slice（×40）

2.2 組織病理分析

模型組表皮增厚、過度角化、細胞間水腫、表皮和真皮內(nèi)有大量淋巴細胞浸潤;對照組組織病理無明顯改變(圖2)。

2.3 血清IgE和IL-4的濃度

與對照組血漿 IgE濃度(10.96±4.03 ng/mL)相比，外用 DNCB7周后，模型組血漿 IgE濃度(165.65±12.16 ng/mL)顯著增加(P<0.05)。與對照組血漿與對照組血漿 IL-4濃度(62.03± 11.15 pg/mL)相比，模型組血漿IL-4濃度(87.75± 2.25 pg/mL)顯著增高(P<0.05)。

2.4 小鼠耳朵厚度和搔抓行為

在用DNCB之后，平均小鼠耳朵厚度為0.75± 0.033 mm，與對照組(0.24±0.014 mm)相比，差異顯著(P<0.05)。和對照組小鼠搔抓行為頻次(2.4 ±1.14)相比，重復(fù)外用DNCB7周后，小鼠搔抓行為頻次(18.6±1.82)顯著增加(P<0.05)。

3 討論

特應(yīng)性皮炎，原稱“異位性皮炎”、“遺傳過敏性皮炎”，是一種與遺傳過敏素質(zhì)有關(guān)的特發(fā)性皮膚炎癥性疾病。本病表現(xiàn)為劇烈瘙癢、多形性皮損并有滲出傾向，常有易患哮喘、過敏性鼻炎、濕疹的家族性傾向，對異種蛋白過敏，血清中 IgE水平升高，外周血嗜酸性粒細胞增多。患者Th2細胞在皮損中顯著增高，其產(chǎn)生的 IL-4和 IL-5增多，可導(dǎo)致 IgE增高和嗜酸性粒細胞的增多。病因尚不完全清楚，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，兒童發(fā)病與其父母過敏素質(zhì)明顯相關(guān)。母親一方有特應(yīng)性皮炎者，其子女出生后3個月內(nèi)發(fā)病率可達25%以上，2歲內(nèi)發(fā)病率可達50%以上;如果父母雙方均有特應(yīng)性疾病史，其子女特應(yīng)性皮炎發(fā)病率可高達79%。外界環(huán)境中的變應(yīng)原(如屋塵螨、花粉等)可誘發(fā)AD，某些患者用變應(yīng)原進行皮試可出現(xiàn)皮膚濕疹樣改變?？傊貞?yīng)性皮炎的病因與發(fā)病機制目前還不很清楚，迫切需要建立一個合適的動物模型，以明確慢性瘙癢的機制并研發(fā)控制慢性炎性疾病中瘙癢的藥物。以往在AD研究中應(yīng)用的動物模型，均為對正常動物反復(fù)致敏而成，它與以特應(yīng)性遺傳素質(zhì)為發(fā)病基礎(chǔ)的AD有著本質(zhì)區(qū)別。

1997年，日本東京農(nóng)工大學(xué)農(nóng)學(xué)部 Matsuda等［2］在世界上首次發(fā)表了與人類AD十分相似的動物模型 NC/Nga鼠的研究報告。Matsuda報道 NC/ Nga小鼠在普通環(huán)境下飼養(yǎng)可以出現(xiàn)嚴重的瘙癢，皮膚干燥并有皮膚屏障功能障礙，皮損病理表現(xiàn)為棘層水腫，表皮肥大細胞增多、炎性細胞浸潤，血漿IgE和Th2細胞因子如IL-4水平升高。塵螨是誘發(fā)AD最重要的自然變應(yīng)原，而粉塵螨是其中最普遍的一種。應(yīng)用粉塵螨刺激NC/Nga鼠和BALB/c鼠背部皮膚，每周3次，連續(xù)8周后NC/Nga鼠出現(xiàn)類似AD的皮損和免疫生化改變，而BALB/c鼠僅特異性IgE升高，未出現(xiàn)類似皮損［3］。可見，NC/Nga鼠對外界抗原的免疫反應(yīng)與AD患者類似。

近來的多個研究發(fā)現(xiàn)，在普通環(huán)境下飼養(yǎng)時，并非所有NcNga小鼠都能自發(fā)產(chǎn)生 AD樣皮損［4－6］，需應(yīng)用半抗原或者螨蟲抗原激發(fā)穩(wěn)定的濕疹。我們采用1%DNCB重復(fù)刺激Nc/Nga小鼠的方法，以誘發(fā)小鼠皮炎。通過觀察小鼠皮膚，測量耳朵厚度及其搔抓行為，評價炎性程度，并檢驗血漿內(nèi)IL-4、IgE的含量來判斷模型是否制作成功。試驗顯示我們從日本Charles River Laboratories Japan引進的Nc/Nga小鼠，在普通環(huán)境中生長7周，均未發(fā)現(xiàn)小鼠的明顯搔抓行為，皮膚沒有紅斑、丘疹、結(jié)痂、鱗屑等改變，說明此鼠在普通環(huán)境下生長并沒有明顯的皮炎產(chǎn)生，與上述發(fā)現(xiàn)相似。我們第一次應(yīng)用DNCB刺激小鼠足墊及除毛的腹部后1周內(nèi)，局部皮膚未出現(xiàn)任何炎性反應(yīng)，說明 DNCB對皮膚沒有直接損傷。重復(fù)外用DNCB7周，可以引起Nc/Nga小鼠明顯的濕疹樣改變，耳部、頸、項、背部出現(xiàn)脫毛、紅斑、滲出、表皮剝脫、結(jié)痂，雙側(cè)耳朵出現(xiàn)腫脹、出血、結(jié)痂等表現(xiàn);組織 HE染色顯示小鼠表皮增厚、過度角化、細胞間水腫，表皮和真皮內(nèi)有大量淋巴細胞浸潤。上調(diào)血漿中IgE和IL-4的濃度，同時伴有搔抓行為的增加。這種慢性瘙癢性皮損并伴隨 IgE和 IL-4的增高，提示此模型為Th2型細胞反應(yīng)占優(yōu)的炎癥，與人類特應(yīng)性皮炎有相似之處。

總之，我們通過外用DNCB刺激Nc/Nga小鼠，成功的建立了 AD樣慢性瘙癢性模型，這個模型對于研發(fā)治療AD的新藥是一個有效的工具。

［1］Pokharel YR，Lim SC，Kim SC，et al.Sopungyangjae-Tang inhibits development of dermatitis in Nc/Nga mice［J］.eCAM，2008，5 (2):173－180.

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Establishment of Atopic Dermatitis Model with Nc/Nga Mice Sensitized and Challenged with DNCB

GUO Ya-nan，WEN Hai-quan
(Department of Dermatology，Central South University XiangYa Second Hospital，Changsha 410011，China)

Objective To determine the effect of DNCB in the Nc/Nga mice and to explore the ways of establishing AD models.Methods DNCB was repeatedly applied to the ear of NC/Nga mice.Atopic dermatitis-like skin lesions were evaluated by ear thickness，skin histology and immunological parameters.Results Repeated application of DNCB caused rapid increase in ear thickness.Clinical and histological symptoms(dermal and epidermal thickening，hyperkeratosis，parakeratosis and inflammatory cell infiltration)in this model were very similar to those in human atopic dermatitis.Serum IgE and IL-4 levels were elevated in this model compared with normal mice.Conclusions These results suggest that our model is useful for elucidating the pathogenesis of atopic dermatitis.

Atopic dermatitis;Model，animal;Nc/Nga mice

book=12,ebook=1

R758.23

A

1671-7856(2010)05-0012-03

2009-12-15

郭亞南(1976－)，男，博士，從事斯奇康治療特應(yīng)性皮炎的機理研究。

文海泉(1945－)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事炎癥性皮膚病的研究。