謝日青，陶 濤，陳民利，朱科燕，潘永明，周衛(wèi)民，冷曉霞，肖 慧，艾秀峰，余 佳

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

研究報(bào)告

D－半乳糖致衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶和行為學(xué)觀察及中藥干預(yù)作用

謝日青，陶 濤，陳民利，朱科燕，潘永明，周衛(wèi)民，冷曉霞，肖 慧，艾秀峰，余 佳

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

目的觀察D－半乳糖致衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和行為學(xué)情況，并探討中藥的干預(yù)作用。方法大鼠每日一次頸背部皮下注射5%D－半乳糖100 mg/kg。誘導(dǎo)大鼠衰老模型，連續(xù)7周，觀察衰老模型大鼠的自主活動次數(shù)、空間記憶能力、主動回避遭受電擊能力、探究活動等行為學(xué)表現(xiàn)和學(xué)習(xí)記憶能力，并用抗衰老片與首烏延壽片進(jìn)行干預(yù)，觀察中藥的干預(yù)作用。結(jié)果皮下注射D－半乳糖造模后，衰老模型大鼠自主活動次數(shù)顯著減少(P＜0.05，P＜0.01)，水迷宮試驗(yàn)探索路徑長度和搜臺潛伏期顯著延長(P＜0.05，P＜0.01)，曠場試驗(yàn)移動路程長度和直立次數(shù)顯著減少(P＜0.01)，穿梭回避試驗(yàn)平均潛伏期、進(jìn)入錯誤區(qū)時(shí)間顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)。給予抗衰老片與首烏延壽片干預(yù)后，衰老大鼠的自主活動次數(shù)顯著增加(P＜0.01)，水迷宮試驗(yàn)探索路徑長度和搜臺潛伏期顯著縮短(P＜0.01)，曠場試驗(yàn)移動路程長度和直立次數(shù)顯著增加(P＜0.01)，穿梭回避試驗(yàn)平均潛伏期、進(jìn)入錯誤區(qū)時(shí)間顯著減少(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)論D－半乳糖致衰老模型大鼠的自主活動次數(shù)減少，對新環(huán)境探索能力下降，學(xué)習(xí)記憶力下降;抗衰老片與首烏延壽片等中藥可有效增強(qiáng)衰老模型大鼠的行為活動，提高衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

D－半乳糖;大鼠衰老模型;抗衰老片;首烏延壽片;記憶能力;行為

21世紀(jì)，人口老齡化已成為全球性的社會問題，衰老與抗衰老藥物的研究已成為當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。自然衰老機(jī)體具有代謝紊亂、免疫功能低下和基因表達(dá)與調(diào)控功能異常等特征，表現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能下降，行動反應(yīng)遲緩、對新環(huán)境適應(yīng)能力差［1，2］。我國歷代醫(yī)家對預(yù)防衰老研究頗多，其中有效處方共有七十之多，反映了我國古代在抗衰老方面就已經(jīng)積累了豐富成效。D－半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老動物模型在國內(nèi)外已被廣泛應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)采用D－半乳糖誘導(dǎo)衰老模型大鼠，觀察模型大鼠的行為活動和學(xué)習(xí)記憶能力的變化，并探討抗衰老片和首烏延壽片等中藥的干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級Wistar大鼠，48只，雌雄各半，體重:雌200～220 g，雄240～260 g，來源:中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心/上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司［SCXK(滬) 2007～0005］，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障系統(tǒng)內(nèi)［SYXK(浙)2003～0003］。

1.2 試驗(yàn)藥物及其配制

抗衰老片(浸膏粉):批號080320，臨用前用蒸餾水溶解至濃度30 mg/mL;首烏延壽片:批號為A060801，臨用前用蒸餾水溶解至濃度52.5 mg/mL。

1.3 主要試劑

D－半乳糖，批號:20071115，上海試劑二廠;戊巴比妥鈉，批號:F20041117，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4主要儀器

AF100雪花狀制冰機(jī)，美國SCOTSMAN;YLS－1A多功能大鼠活動記錄儀，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站;Morris水迷宮系統(tǒng)，西班牙Panlab公司;LM 1000型大小鼠穿梭箱，美國Kinder Scientific公司。

1.5 造模與給藥

造模方法參照文獻(xiàn)［3］。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按體重隨機(jī)分為4組:正常組、模型組，抗衰老片組、首烏延壽片組，每組12只，雌雄各6只，按3只/籠飼養(yǎng)，自由飲食。除正常對照組外，其余各組每天一次頸背部皮下注射5%D－半乳糖100 mg/kg，正常對照組注射同容積的生理鹽水，連續(xù)造模7周。同時(shí)，抗衰老片組按10 mL/kg經(jīng)口灌胃，給藥劑量為300 mg/kg，首烏延壽片按10 mL/kg經(jīng)口灌胃，給藥劑量為525 mg/kg，模型對照組和正常對照組灌胃給予蒸餾水10 mL/kg，每日一次，連續(xù)給藥7周。

1.6 指標(biāo)觀察

1.6.1 自主活動測試:采用大鼠自主活動儀記錄自主活動數(shù)。實(shí)驗(yàn)在微光、微聲的環(huán)境中，將大鼠放入自主活動桶中，蓋上桶蓋，使之適應(yīng)1 min，記錄大鼠3 min內(nèi)的自主活動數(shù)。在造模開始前、造模4周、造模7周，測試各組大鼠自主活動次數(shù)。

1.6.2 Morris水迷宮法記憶能力測試［4，5］:試驗(yàn)第6周測試。迷宮水池高50 cm，直徑120 cm，站臺直徑10.0 cm，壁上標(biāo)有A、B、C、D四個入水點(diǎn)，將水迷宮等分成4個象限。迷宮上方有一與計(jì)算機(jī)相連接攝像機(jī)，可利用計(jì)算機(jī)軟件對試驗(yàn)大鼠活動進(jìn)行全程跟蹤，并顯示整個活動軌跡。用找到站臺所需的時(shí)間表示大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。實(shí)驗(yàn)在隔音安靜的房間內(nèi)進(jìn)行，水溫控制在22℃ ±0.5℃，正式測試前，需一天訓(xùn)練2次，每次訓(xùn)練2 min且每次從不同點(diǎn)將試驗(yàn)大鼠放入水迷宮中，若動物2 min尚未找到站臺，將動物拿到站臺上并使它在上面停留20 s。第3天隨機(jī)選一下水點(diǎn)進(jìn)行水迷宮測試。

1.6.3 穿梭箱法學(xué)習(xí)記憶能力測試［6］:實(shí)驗(yàn)第45天后開始，每天訓(xùn)練1次，連續(xù)3 d，第4天進(jìn)行正式測試。系統(tǒng)參數(shù)設(shè)為循環(huán)次數(shù)20次，間隔時(shí)間5 s，暗示燈時(shí)間5 s，電擊時(shí)間10 s。記錄每只大鼠的遭受電擊次數(shù)，遭受電擊的總時(shí)間及逃避潛伏期。

1.6.4 曠場試驗(yàn)行為測試:實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求:暗光、無噪聲。將大鼠置于曠場實(shí)驗(yàn)箱，每只大鼠觀察5 min。操作者握住大鼠的尾巴根部1/3處，輕輕將大鼠放入開闊箱的中央格，并開始計(jì)時(shí)，并用紅外攝像系統(tǒng)記錄大鼠的運(yùn)動軌跡，并由計(jì)算機(jī)自動記錄和分析，觀察記錄大鼠在5 min內(nèi)的行為舉動。主要觀察:①中央格停留時(shí)間:即大鼠被放入開闊箱中央格至其三爪跨離該格的時(shí)間;②直立次數(shù):兩前爪騰空1 cm以上或攀附墻壁次數(shù);③理毛修飾次數(shù):即前肢向上抬舉，抓癢、洗臉，舔足的次數(shù);④移動路程:計(jì)算5 min內(nèi)大鼠的移動路程;⑤平均速度:計(jì)算大鼠在移動過程中的平均速度;⑥糞便粒數(shù):實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，遺留在箱底的糞便數(shù)(每只大鼠實(shí)驗(yàn)完畢取出后，及時(shí)清理其排泄物，將開闊箱打掃干凈，以免留有氣味而干擾下一只大鼠的實(shí)驗(yàn))。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用ANOVA進(jìn)行方差分析，如方差齊性，采用LSD－t檢驗(yàn);如方差不齊，經(jīng)參數(shù)轉(zhuǎn)換后使方差齊性后進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 D-半乳糖致衰老大鼠自主活動觀察和中藥的干預(yù)效果

與正常對照組比，模型對照組衰老大鼠的自主活動次數(shù)在造模4周后顯著降低(P＜0.01)，并隨著造模時(shí)間的推移，自主活動次數(shù)進(jìn)一步減少(P＜0.01);與模型對照組比，抗衰老片組和首烏延壽片組衰老大鼠的自主活動次數(shù)均顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)(表1)。

表1 D－半乳糖致衰老大鼠自主活動次數(shù)的影響及中藥干預(yù)效果(n=12)Tab.1 Changes of the locomotor activity of ageing rats induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

2.2 D-半乳糖致衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變和中藥干預(yù)效果

與正常對照組比，模型對照組衰老大鼠水迷宮探索路徑長度、搜臺潛伏期均顯著延長(P＜0.01)，對游泳平均速度無明顯影響(P＞0.05);與模型對照組比，抗衰老片組和首烏延壽片組衰老大鼠探索路徑長度和搜臺潛伏期顯著縮短(P＜0.01)，但對平均速度無明顯影響(P＞0.05)(表2)。

表2 D－半乳糖致衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變和中藥干預(yù)效果(n=12)Tab.2 Changes of memory ability of ageing rats induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

2.3 D-半乳糖致衰老大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果和中藥干預(yù)效果

與正常對照組比，模型對照組衰老大鼠移動路程長度、平均速度、直立次數(shù)均出現(xiàn)顯著的減少(P＜0.05)，而停留時(shí)間有所延長(P＞0.05)，糞便粒數(shù)和理毛修飾次數(shù)減少(P＞0.05);與模型對照組比，抗衰老片組和首烏延壽片組衰老大鼠移動路程長度、平均速度和直立次數(shù)均顯著增加(P＜0.05)，同時(shí)，抗衰老片組停留時(shí)間有縮短和糞便粒數(shù)增加的趨勢(P＞0.05)，首烏延壽片組的停留時(shí)間有縮短和理毛修飾次數(shù)增加的趨勢(P＞0.05)(表3)。

表3 D－半乳糖致衰老大鼠曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果和中藥干預(yù)效果(n=12)Tab.3 Open－field test results of ageing rats induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

2.4 D-半乳糖致衰老大鼠穿梭回避實(shí)驗(yàn)結(jié)果和中藥干預(yù)效果

與正常對照組比，模型對照組衰老大鼠平均潛伏期、進(jìn)入錯誤區(qū)時(shí)間均顯著延長(P＜0.01)遭受電擊次數(shù)和電擊時(shí)間顯著增多(P＜0.01);與模型對照組比，抗衰老片組衰老大鼠平均潛伏期、進(jìn)入錯誤區(qū)時(shí)間顯著減少(P＜0.01)遭受電擊次數(shù)和電擊時(shí)間顯著下降(P＜0.05)。首烏延壽片組衰老大鼠，平均潛伏期、進(jìn)入錯誤區(qū)時(shí)間顯著減少(P＜0.05)遭受電擊次數(shù)和電擊時(shí)間亦有下降趨勢(P＞0.05)(表4)。

表4 D－半乳糖致衰老大鼠穿梭回避實(shí)驗(yàn)結(jié)果和中藥干預(yù)效果(n=12)Tab.4 Shuttle－box test results of ageing rats induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

3 討論

衰老是一多環(huán)節(jié)的生物學(xué)過程，指機(jī)體發(fā)育成熟后，組織器官逐步發(fā)生退行性改變，機(jī)體功能下降和紊亂，表現(xiàn)為記憶力減退、免疫功能下降以及糖脂代謝紊亂和肝腎功能的異常等癥狀［7］。D－半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老動物模型在國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，其機(jī)理一方面D－半乳糖在體內(nèi)被還原成半乳糖醇，堆積在細(xì)胞內(nèi)影響正常滲透壓，使細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂，導(dǎo)致衰老的發(fā)生［8］;另一方面D－半乳糖在其氧化酶的作用產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致衰老的發(fā)生［9］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn) D－半乳糖誘導(dǎo)衰老大鼠模型出現(xiàn)活動次數(shù)減少，學(xué)習(xí)記憶力下降，對新環(huán)境探索能力降低，并隨著時(shí)間的推移衰老癥狀加重，這與人類的自然衰老癥狀與衰老進(jìn)程類似，與國內(nèi)外研究報(bào)道相一致［10－14］，提示 D－半乳糖致衰老模型適用于老年性疾病、治療藥物的篩選及其作用機(jī)理研究。

中醫(yī)藥在抗衰老方面有著豐富的經(jīng)驗(yàn)和獨(dú)特的效果?？顾ダ掀菑墓欧街邪l(fā)掘出來的經(jīng)典中藥復(fù)方，經(jīng)現(xiàn)代制劑工藝加工制得，具有多方面的藥理作用，在臨床上使用已二十多年，其療效已得到廣泛認(rèn)可，其組方成分可能有著多靶點(diǎn)的協(xié)同效應(yīng)。何首烏能“黑髭發(fā)，悅顏色，延年不老”，其延緩衰老的作用是對機(jī)體具有增強(qiáng)免疫功能、抗氧化作用、延緩大腦衰老、提高DNA修復(fù)功能、延長壽命及降低血脂［15］。本研究結(jié)果顯示，而給予抗衰老片與首烏延壽片后，可有效增加D－半乳糖誘導(dǎo)衰老大鼠模型自主活動次數(shù)，提高學(xué)習(xí)記憶力和探究活動能力，提示抗衰老片與首烏延壽片等中藥可降低腦的衰老程度或延緩腦的衰老進(jìn)程。

Morris圓形水迷宮主要用于測試動物(大、小鼠)對空間位置覺和方位覺的學(xué)習(xí)記憶能力［16］。穿梭箱被動回避反應(yīng)是一種經(jīng)典的測定動物情緒記憶以及記憶保持能力的方法，它包括學(xué)習(xí)、記憶形成和記憶消退 3個連續(xù)的過程［17］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠水迷宮試驗(yàn)中的探索路徑長度和搜臺潛伏期顯著延長;穿梭回避試驗(yàn)平均潛伏期、進(jìn)入錯誤區(qū)時(shí)間顯著增多，提示衰老模型大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶力明顯下降;給予抗衰老片和首烏延壽片后，可顯著縮短衰老大鼠水迷宮試驗(yàn)中的探索路徑長度和搜臺潛伏期，顯著減少衰老大鼠穿梭回避試驗(yàn)平均潛伏期、進(jìn)入錯誤區(qū)時(shí)間，表明抗衰老片和首烏延壽片可有效提高衰老大鼠的空間學(xué)習(xí)、認(rèn)知記憶能力和回避遭受電擊的能力，提示抗衰老片和首烏延壽片可降低腦的衰老程度。

動物的自主活動情況反映其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài)，是評價(jià)中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮狀態(tài)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，興奮時(shí)活動次數(shù)增加，抑制時(shí)活動次數(shù)減少［18］。曠場實(shí)驗(yàn)是一個經(jīng)典的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，能很好的評定動物的情緒性水平以及在開放的陌生環(huán)境中的探索行為［19］。本研究結(jié)果顯示，模型對照組衰老大鼠自主活動次數(shù)、移動路程長度、平均速度、直立次數(shù)均出現(xiàn)顯著的減少，而停留時(shí)間有所延長，提示衰老大鼠對新環(huán)境的空間認(rèn)知能力、興奮性、探索行為明顯減弱;給予抗衰老片和首烏延壽片后，均能顯著增加衰老大鼠自主活動次數(shù)、移動路程長度、平均速度和直立次數(shù)，表明抗衰老片和首烏延壽片可提高衰老大鼠對開放陌生環(huán)境的探索興趣和適應(yīng)能力，提示抗衰老片和首烏延壽片可延緩腦的衰老進(jìn)程。

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Research on Learning Memory Ability and Behavior of Ageing Model Rat Induced by D-galactose and Interventional Effect of Traditional Chinese Medicine

XIE Ri－qing，TAO Tao，CHEN Min－li，ZHU Ke－yan，PAN Yong－ming，ZHOU Wei－min，LENG Xiao－xia，XIAO Hui，AI Xiu－feng，YU Jia
(Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center，Hangzhou 310053，China)

ObjectiveTo observe the memory ability and the behavior activities of ageing model rats induced by D－galactose and the interventional effect of traditional Chinese medicine。MethodsThe ageing model rats were injected with 5%D－galactose subcutaneously at a dose of 100 mg/kg everyday and lasted for 7 weeks.During the experiment，locomotor activity was tested.Morris water maze was used to test inquiry and search memory，shuttle box was employed to measure the avoidance ability and open－field test was also adopted to check explore activity and emotional response. Results The model control group rats locomotor activity decreased obviously(P＜0.01)，the explore length and searchlatency in water maze test prolonged remarkably(P＜0.05，P＜0.01)，the move length，average speed and vertical frequency decreased significantly(P＜0.05，P＜0.01)，and the average latency，time in error area increased significantly (P＜0.05，P＜0.01).After administration of drugs，the locomotor activity enhanced obviously(P＜0.01)，the explore length and search latency in water maze test shortened remarkably(P＜0.01)，the move length，average speed and vertical frequency increased significantly(P＜0.05，P＜0.01).The average constancy and time in error area decreased significantly(P＜0.05，P＜0.01)。Conclusions The locomotor activities and learning memory ability and explore activity and emotional response of ageing rats induced by D－galactose decreased obviously.The behavior and learning memory ability can be improved effectively after administration of traditional Chinese medicine.

D－galactose;Ageingratmodel;Anti－ageingtablets;ShouWuYanShou tablets;Memory ability;Behavior

R332;R285.5

A

1671－7856(2010)05－0032－05

2009－12－24

浙江省中醫(yī)“治未病”研究專項(xiàng)(2007WB022);“浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目”資助。

謝日青，男，碩士生。

陳民利(1963－)，女，教授、碩導(dǎo)，研究方向:比較醫(yī)學(xué)。E－mail:minlichen01@yahoo.com.cn