李霞

（湖南省湘潭市第二人民醫(yī)院藥劑科，湖南湘潭 411100）

四黃瀉火片、麻仁丸中非法添加土大黃苷檢測方法的建立

李霞

（湖南省湘潭市第二人民醫(yī)院藥劑科，湖南湘潭 411100）

目的：建立四黃瀉火片、麻仁丸中非法添加土大黃的檢測方法。方法：采用薄層色譜法（TLC）結(jié)合高效液相色譜法（HPLC）快速鑒別。結(jié)果：該薄層色譜法鑒別法（TLC）加高效液相色譜法（HPLC）穩(wěn)定性和重復(fù)性好。結(jié)論：TLC結(jié)合HPLC簡便、快速、專屬性強(qiáng)，能有效地檢查四黃瀉火片、麻仁丸中是否摻入土大黃。

四黃瀉火片；麻仁丸；土大黃苷；薄層色譜法；高效液相色譜法

四黃瀉火片、麻仁丸中均含有大黃成分，按照標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)[1-3]，結(jié)果符合規(guī)定，但在檢驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)薄層斑點(diǎn)異常，研究其處方成分并調(diào)用參照樣品進(jìn)行陰性對(duì)照，懷疑該品種摻入了土大黃。土大黃主要成分是土大黃苷。土大黃苷為二苯乙烯的衍生物，存在于劣質(zhì)大黃中[4-5]。為了有效杜絕摻偽，本文建立了快速篩查四黃瀉火片、麻仁丸是否非法摻偽土大黃的薄層鑒別方法，并用HPLC法予以確證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器和設(shè)備

島津LC-20A高效液相色譜儀，SPD－M20A檢測器，LC-solution色譜工作站，梅特勒-托利多AG135型天平（德國Sartorius），CTO－10AS 柱溫箱，KQ2200E 型超聲波清洗器；10×20 cm硅膠G薄層層析板（青島海洋化工廠分廠，20081211）[6-7]。

1.2 試劑

乙腈為色譜級(jí)；其他試劑為分析純；純化水（自制）。

1.3 試藥

供試品：四黃瀉火片，麻仁丸。

參照樣品粉末：按標(biāo)準(zhǔn)中提供的處方及制法制備。陰性樣品粉末：按標(biāo)準(zhǔn)中提供的處方，去大黃后依法制備。土大黃苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)794-200103）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC法

2.1.1 溶液的配制

陰性樣品溶液的制備：取陰性樣品粉末約1 g，照供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法制備。

參照樣品溶液的制備：取參照樣品粉末約1 g，照供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法制備。

對(duì)照品溶液制備：精密稱取土大黃苷對(duì)照品1 mg，加甲醇5 ml使溶解，制成濃度0.2 mg/ml的溶液。

2.1.2 薄層色譜條件

硅膠G薄層層析板（10×20 cm）；展開劑：三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）；點(diǎn)樣量：10 μl；溫度：24℃；相對(duì)濕度：52%。 三氯甲烷-醋酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開劑，展開后，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。

2.1.3 方法

分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μl，觀察。

2.1.4 試驗(yàn)結(jié)果

抽屜原理是將需要討論的元素按一定特質(zhì)分類，當(dāng)取出足夠多的元素時(shí)，再運(yùn)用抽屜原理將范圍縮小，從而推導(dǎo)出屬于同一類的某幾種元素，它們均同時(shí)具備某種特質(zhì)，由此推導(dǎo)出題目的結(jié)論。運(yùn)用抽屜原理時(shí)通常會(huì)出現(xiàn)以下幾個(gè)特點(diǎn)：第一、題目中所討論的元素具備任意性；第二、題目的結(jié)論至少要有一類是具備某種特質(zhì)的，是一個(gè)存在性命題；第三、結(jié)論不需要確定，但需存在。

四黃瀉火片與麻仁丸供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色呈亮藍(lán)色，與土大黃對(duì)照品溶液的一致；測定斑點(diǎn)位置時(shí)，RF為0.65，與土大黃對(duì)照品一致。而參照樣品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置與土大黃苷對(duì)照品溶液的不一致（圖1），提示四黃瀉火片與麻仁丸可能均摻入土大黃。

2.2 HPLC法

2.2.1 溶液的制備

供試品溶液的制備：取四黃瀉火片10片，除去包衣，稱定重量，研細(xì)，混勻，（或取麻仁丸適量，剪碎），精密稱取0.5 g，置錐形瓶中。加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)充減失重量，混勻，濾過用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

圖1 四黃瀉火片與麻仁丸片的TLC圖

對(duì)照品溶液制備：精密稱取對(duì)照品8 mg于100 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

陰性樣品溶液的制備：精密稱取陰性樣品粉末0.5 g,照供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法制備。

參照樣品溶液的制備：精密稱取對(duì)參照樣品粉末0.5 g，照供試品溶液的制備項(xiàng)下的方法制備。

2.2.2 色譜條件

色譜柱：資生堂 CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-水(18∶82)為流動(dòng)相，檢測波長 324 nm，流速為1.0 ml/min，進(jìn)樣量：10 μl，柱溫：35℃，理論板數(shù)土大黃苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000[1]。土大黃苷峰與各雜質(zhì)峰分離度均應(yīng)大于2。自動(dòng)進(jìn)樣。

2.2.3 結(jié)果

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液，陰性樣品溶液，參照樣品溶液各10 μl進(jìn)樣測定。結(jié)果表明：供試品溶液中主峰保留時(shí)間與土大黃苷對(duì)照品溶液的色譜峰保留時(shí)間一致，通過DAD檢測進(jìn)一步檢測，主峰與土大黃苷峰的DAD（紫外光譜圖）一致且雜質(zhì)不干擾樣品測定，而參照樣品溶液在土大黃苷對(duì)照品主峰相應(yīng)保留時(shí)間未出現(xiàn)色譜峰。對(duì)照品溶液、供試品溶液色譜圖見圖2，DAD光譜圖見圖3。

2.2.4 方法學(xué)

2.2.4.1 精密度試驗(yàn)色譜條件：精密吸取土大黃苷對(duì)照品溶液10 μl，連續(xù)進(jìn)樣7次，記錄對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間，分別為12.585、12.563、12.546、12.523、12.489、12.496、12.501 min，RSD為0.3%，結(jié)果表明，進(jìn)樣精密度良好。

2.2.4.2 最低檢出限的測定：精密吸取土大黃苷對(duì)照品溶液，并釋釋至刻度，搖勻，精密吸取1 ml，置100 ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。照上述色譜條件，進(jìn)樣5 μl，記錄色譜圖，結(jié)果信噪比為S/N為13∶1時(shí)，最低檢出限為 4×10-3μg，信噪比為S/N為3∶1時(shí)，最低檢出限為0.916×10-3μg。

3 討論

為了測定土大黃苷的含量，流動(dòng)相采用甲醇-乙腈-水溶液（用磷酸調(diào)節(jié) pH3.5）（35∶5、60），乙腈-0．1%磷酸溶液（加入0．1%三乙胺）（20∶80），乙腈-水（18∶82），經(jīng)過試驗(yàn)，采用乙腈-水（18∶82）檢出的色譜峰最理想，土大黃苷色譜峰能達(dá)基線分離。理論板數(shù)為16 000。供試品土大黃苷色譜峰與其他質(zhì)譜分離度大于2.0。故選此系統(tǒng)作為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 HPLC色譜圖

供試品的提取溶劑及方法的考察，分別采用乙酸乙酯、乙腈、甲醇作為溶劑的考察，結(jié)果以甲醇為提取溶劑提取30 min效果最好。

測定波長的選擇：在高效液相色譜條件下，利用二極管陳列檢測器對(duì)土大黃苷對(duì)照品在200～400 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果土大黃苷在219 nm、324 nm波長處均有最大吸收，其中324 nm響應(yīng)植最高且波長適中，確定324 nm為檢測波長。

判斷標(biāo)準(zhǔn)：薄層；供試品色譜中，在供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，不得顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。若出現(xiàn)相同顏色的熒光斑點(diǎn)，則用下列高效液相色譜法驗(yàn)證。在液相色譜圖中，應(yīng)不得出現(xiàn)與對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的色譜峰。若出現(xiàn)可以判斷為不合格。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法采用TLC結(jié)合HPLC法相結(jié)合檢測手段，用于篩查和檢測四黃瀉火片、麻仁丸是否摻入土大黃，保證人民用藥安全。

[1]國家藥典委員會(huì).中國藥典2005年版[M].一部北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:384.

[2]國家藥品監(jiān)督管理局.中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)部分內(nèi)科脾胃分冊(cè)[S].WS-10940（ZD-0940）-2002.

[3]王啟硯.HPLC法測定麻仁丸中大黃素和大黃酚的含量[J].中國藥師,2006,9(7):622-623.

[4]盧兗偉.金錢草與土大黃有效成分研究與應(yīng)用[D].北京:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2003.

[5]馬錦星.補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和項(xiàng)目是打擊藥品摻雜、摻假行為的有效手段[J].中國藥事,2004,18(3):158.

[6]羅一,李林松.四黃瀉火片、麻仁丸中非法添加土大黃檢查方法的建立[J].中國實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2010,20(4):59.

[7]劉艷,張勤.婦炎康膠囊中非法添加化學(xué)藥品的快速檢測[J].中國藥師,2010,13(6):887-888.

Establishment of a method of determining Rhaponitin in Sihuang Xiehuo tablets and Maren pill

LI Xia
(Pharmaceutical preparation section,the Second People's Hospital of Xiangtan,Hunan Province,Xiangtan 411100,China)

Obiective:To establish a method for the identification of rhaponitin in Sihuang Xiehuo tablets and Maren pill.Methods:Both the HPLC and TCL were employed to identify..ResultsThe method of TLC combimed with HPLC had good stability and repeatability.Conclusion:The method is convenient,fast and selective,can identify the Rhaponitin in Sihuang Xiehuo tablets and Maren pill effectively.

Sihuang Xiehuo tablets;Maren pill;Rhaponitin;TLC;HPLC

R943.1

B

1674-4721（2010）12（a）-052-02

2010-10-14）