東莞市虎門鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心 陳穎杰

淺談豬腺病毒的鑒定

東莞市虎門鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心 陳穎杰

根據(jù)豬腺病毒保守區(qū)六鄰體基因設(shè)計(jì)兩對簡并引物，建立了nested PCR的檢測方法，對病豬的氣管分泌物作檢測，并用其中的陰性病料接種PK-15細(xì)胞，做病毒分離，次分離到了豬腺病毒，并進(jìn)行了鑒定。

豬腺病毒 nested PCR 分離 鑒定

一、引言

腺病毒寄生于人和動(dòng)物以及禽類的眼、上呼吸道和消化道內(nèi)，但大多呈隱性或不顯性感染。人的腺病毒大多存在于腸道內(nèi)，但也與感冒、咽炎、急性呼吸道感染和結(jié)膜炎等一系列疾病有關(guān)。動(dòng)物中的腺病毒很多，但只少數(shù)引起臨床癥狀。豬腺病毒是于1964年在英格蘭首次被分離的，此后，通過病毒分離和血清學(xué)調(diào)查逐步證明豬腺病毒在豬群中廣泛存在。本文探討豬腺病毒的分離和鑒定，將為進(jìn)一步研究豬腺病毒的生物學(xué)特性以及豬腺病毒載體的構(gòu)建打下基礎(chǔ)。

二、分離鑒定試驗(yàn)

1. 試驗(yàn)病料。

對送檢的病豬剖檢后，用棉拭子取下氣管和支氣管的分泌物，用PBS洗脫棉拭子，洗下的液體經(jīng)凍融三次，離心取上清，加入雙抗保存?zhèn)溆谩?/p>

參照GenBank上豬腺病毒的序列，針對豬腺病毒保守的六鄰體基因設(shè)計(jì)兩對簡并引物，引物由上海生物工程公司合成。

引物序列為：

First lef t GATGTCATGGAYAACGTGAAC

First right CACGGAGGAGTCRAACTGGATG

Nested lef t TACTGCMAGTTYCACATCCATCCACGT

Nested right GGAATGGAGATGGGCAGGTT

2. 試驗(yàn)方案。

本試驗(yàn)方案如圖1所示。

圖1 試驗(yàn)方案

3. 病毒分離。

待細(xì)胞90%長滿單層，倒掉生長液，用Hanks液洗1-2次，加入經(jīng)雙抗處理的上清液，加入量為生長液的十分之一。置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1.5h，每隔15min搖一次。倒掉上清液，加入維持液，即含2-3%小牛血清的DMEM。繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變。無細(xì)胞病變的72h后將細(xì)胞反復(fù)凍融三次，離心取上清，用nested PCR檢測并繼續(xù)接種細(xì)胞，盲傳四代不出現(xiàn)細(xì)胞病變或用nested PCR檢測為陰性的則判為腺病毒分離陰性。

4. 電鏡觀察。

在上電鏡觀察之前，必須先將病毒樣品濃縮，使懸液內(nèi)的被檢病毒有一定的數(shù)量，一般要求106-1010個(gè)病毒粒子/ml較好。本材料為游離的病毒粒子，故可用296的磷鎢酸染色1min左右。鑷子要通過火焰或其他方法徹底清潔，防止污染其他病毒。在觀察時(shí)要先用較暗的光斑照射1-2 min，再逐漸用強(qiáng)光照射，避免出現(xiàn)支持膜破裂或收縮等現(xiàn)象。

經(jīng)過負(fù)染的病毒在電鏡下觀察，可見到與病毒圖譜中腺病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的病毒顆粒。如圖2為放大6.9萬倍的病毒顆粒，圖3為放大4.5萬倍的病毒顆粒。

圖2 6. 9萬倍

圖3 4. 5萬倍

三、鑒定試驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)豬腺病毒保守區(qū)六鄰體基因設(shè)計(jì)兩對引物，特異性高，而且應(yīng)用nested PCR的方法來擴(kuò)增特異性片段，提高了檢測的靈敏度，在一定程度上克服了假陽性的問題。

檢測51份病料，只有1份為豬腺病毒陽性，而分離病毒時(shí)卻能從13份“陰性”病料中分離出10株豬腺病毒，而且為不同的毒株，病毒分離的陽性率達(dá)76.9%。這說明豬腺病毒在豬群中的感染是普遍的，nested PCR的方法盡管靈敏度很高，但是它受很多因素的影響，比如在核酸抽提過程中受到人為因素的影響而使核酸丟失或者帶有太多的雜蛋白而影響酶的作用。當(dāng)然，病毒分離也有人為因素的影響，比如接毒時(shí)病料的PH值和一價(jià)陽離子的濃度都會(huì)影響到病毒的吸附，但是這些因素的調(diào)節(jié)相對于核酸的抽提容易得多。所以，由于人為因素的影響，經(jīng)nested PCR檢測為陰性的病料并不能完全判為陰性，病毒分離才是相對可靠的。

在病毒分離過程中，接毒的每一代細(xì)胞經(jīng)反復(fù)凍融三次后，均作nested PCR檢測，直到第四代仍為陰性的才判為病毒分離陰性。有十份病料在接毒的第一、二代作nested PCR檢測時(shí)均為陰性，而到第三代時(shí)則為陽性，但不出現(xiàn)細(xì)胞病變，其中有四份從第四代到第八代均穩(wěn)定地出現(xiàn)細(xì)胞病變，其余六份傳到第八代仍沒有出現(xiàn)細(xì)胞病變。隨機(jī)抽取引起細(xì)胞病變的一份（命名為GXTL株）和不引起細(xì)胞病變的一份（命名為GXHP株）克隆與測序，并進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)GXTL株與豬腺病毒5型的同源性最高，達(dá)97.4%，GXHP株與豬腺病毒3型的同源性最高，達(dá)95.3%。屬于豬腺病毒五型的GXTL株能引起細(xì)胞病變，而屬于豬腺病毒三型的GXHP株不能引起細(xì)胞病變，這也許與病毒對細(xì)胞的適應(yīng)能力有關(guān)。

四、結(jié)論

本試驗(yàn)用PK-15細(xì)胞分離到10株豬腺病毒，其中有四份能引起細(xì)胞病變，其余六份不引起細(xì)胞病變，隨機(jī)抽取引起細(xì)胞病變的一份（GXTL株）和不引起細(xì)胞病變的 一份（GXHP）克隆與測序，經(jīng)序列比較發(fā)現(xiàn)GXTL株與豬腺病毒五型的同源性最 高，達(dá)97.40l0，屬于豬腺病毒五型，GXHP株與豬腺病毒三型的同源性最高，達(dá)95.3%屬于豬腺病毒三型。

[1] 殷震，劉景華主編.動(dòng)物病毒學(xué)[M]，北京：科技出版社，2003，833-836.

[2] 金玉霞.腺病毒六鄰體蛋白的免疫學(xué)研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊，2005（06）

[3] 張霆，辛若雷.腺病毒六鄰體蛋白型間線性化抗原位點(diǎn)的研究[J].中華試驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志2002， 16 （1） : 44-47