周文婷,胡 揚(yáng),徐 飛,邢亞衛(wèi),衣龍彥

eNOS基因多態(tài)性與急性高山病低氧運(yùn)動(dòng)習(xí)服效果的關(guān)聯(lián)研究

周文婷,胡 揚(yáng),徐 飛,邢亞衛(wèi),衣龍彥

目的:研究eNOS基因的G894 T和4B/4A位點(diǎn)多態(tài)性與急性高山病(AMS)的發(fā)生及其低氧運(yùn)動(dòng)習(xí)服效果的關(guān)系。方法:階段1:在模擬海拔4 800 m低氧環(huán)境中,61名北方漢族大學(xué)生急性暴露6 h,其中,入艙30 min后以恒定負(fù)荷蹬車(chē)20 min(70 r/min),LLS量表評(píng)價(jià)AMS。階段2:恢復(fù)1周后,48名受試者在模擬環(huán)境下進(jìn)行3周(2 h/天,4 d/周)漸進(jìn)式低氧訓(xùn)練,海拔高度分別為2 500 m、3 500 m和4 800 m?；謴?fù)1周后,重復(fù)階段1的低氧暴露和運(yùn)動(dòng),LLS量表評(píng)價(jià)AMS。以PCR-RFLP法檢測(cè)受試者eNOS基因G894T和4B/4A位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率。結(jié)果:階段1中,49.2%的受試者發(fā)生AMS,G894T不同基因型和等位基因攜帶者的AMS發(fā)生率無(wú)顯著差異,4A基因攜帶者的AMS發(fā)生率顯著高于4B攜帶者。低氧運(yùn)動(dòng)前、后,受試者AMS評(píng)分的分布頻率具有非常顯著性差異, 60.4%的受試者低氧耐受力增強(qiáng),4A攜帶者AMS的低氧習(xí)服效果更好。結(jié)論:間歇性低氧暴露輔以運(yùn)動(dòng)對(duì)AMS的低氧習(xí)服效果顯著,4A等位基因是AMS易感性及其低氧習(xí)服效果的遺傳學(xué)標(biāo)記。

基因多態(tài);急性高山病;發(fā)生率;低氧運(yùn)動(dòng)習(xí)服

1 前言

急性高山病(Acute Mountain Sickness,AMS)指高原暴露時(shí),因高原低氧在數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)出現(xiàn)的臨床綜合征,臨床表現(xiàn)由輕到重分為急性輕癥高原病、高原肺水腫(HAPE)和高原腦水腫(HACE)[4]。研究發(fā)現(xiàn),增加氧攝入量和促進(jìn)利尿可促進(jìn)AMS的習(xí)服,故當(dāng)前普遍采用階梯適應(yīng)及服藥的方法預(yù)防AMS[13]。然而,前者耗費(fèi)大量人力、物力和時(shí)間,服藥又多伴有各種副作用,故尋找更有效的方法促進(jìn)高原習(xí)服,降低AMS的發(fā)生及嚴(yán)重程度具有重要的研究?jī)r(jià)值。已知急性低氧暴露期內(nèi)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)會(huì)加重AMS,而適當(dāng)劑量的低氧暴露和/或訓(xùn)練對(duì)改善、緩解AMS具有積極作用[7]。

研究表明,急進(jìn)高原人群中AMS的發(fā)生率約為30%～80%,以階梯適應(yīng)的方式進(jìn)入高原雖可明顯減少AMS的發(fā)生,但仍有30%的人發(fā)病,可見(jiàn)確有AMS易感者[3]。家族研究發(fā)現(xiàn),AMS具有遺傳易感性,一些影響關(guān)鍵酶活性的基因多態(tài)性可能涉及其中,從而使個(gè)體表現(xiàn)出AMS發(fā)生及習(xí)服效果的巨大差異。因此,探尋AMS發(fā)生及其習(xí)服效果的遺傳學(xué)標(biāo)記,不僅可深入理解AMS的病理遺傳機(jī)制,也為未來(lái)AMS的個(gè)性化預(yù)防和控制提供了可行性依據(jù)。

世居高原人血漿內(nèi)NO濃度顯著高于世居平原人,表明其肺部?jī)?nèi)皮具有更高的NO合成水平[6]。NO是內(nèi)皮毛細(xì)血管中已知最主要的舒血管物質(zhì),由血管內(nèi)皮細(xì)胞上的eNOS合成分泌,其氧化產(chǎn)物NOx則與個(gè)體低氧下的機(jī)能紊亂有關(guān)[5]。本研究模擬4 800 m低氧環(huán)境,急性暴露輔以運(yùn)動(dòng),使受試者出現(xiàn)AMS癥狀。對(duì)受試者施以3周漸進(jìn)式低氧訓(xùn)練,觀察低氧運(yùn)動(dòng)對(duì)AMS的減緩程度。通過(guò)基因解析,本研究首次對(duì)我國(guó)世居平原北方漢族男性eNOS基因G894 T及4B/4A位點(diǎn)多態(tài)性與AMS發(fā)生及其低氧運(yùn)動(dòng)習(xí)服效果的關(guān)系進(jìn)行了探索。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與樣本

61名普通男性大學(xué)生參與階段1的研究,其中,48名參與后續(xù)階段2的研究。受試者身體健康,無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)、心肺、心血管系統(tǒng)疾病及吸煙史;均為北方漢族世居平原者(海拔<800 m),主要來(lái)自山東、河北以及東北三省。實(shí)驗(yàn)前6個(gè)月未經(jīng)高原和(或)低氧暴露(海拔≥1 500 m)。受試者實(shí)驗(yàn)前填寫(xiě)PARQ問(wèn)卷,簽署知情同意書(shū)?？崭钩槿§o脈血5 mL,EDTA-Na2抗凝,分離白細(xì)胞,-20℃保存。

2.2 方法

2.2.1 運(yùn)動(dòng)及低氧暴露

階段1:受試者于低氧艙(模擬海拔4 800 m,FIO210.4%～10.8%,Tm 20℃～24℃,相對(duì)濕度46%～67%,氣壓1 014 hPa～1 021hPa)暴露6 h。進(jìn)艙后休息30 min,然后進(jìn)行30 min的運(yùn)動(dòng)測(cè)試:在GE Ergoselect 1000 LP型臥式功率車(chē)上仰臥休息5 min后,以恒定負(fù)荷(80 W,60 rPm)蹬車(chē)20 min,恢復(fù)5 min,運(yùn)動(dòng)終止標(biāo)準(zhǔn)參照[9]。運(yùn)動(dòng)結(jié)束后,受試者在6 h的剩余時(shí)間內(nèi)靜息暴露。采用LLS量表評(píng)價(jià)AMS[8],運(yùn)動(dòng)前和運(yùn)動(dòng)后即刻、低氧暴露4 h和6 h結(jié)束時(shí)記錄AMS評(píng)分。將受試者6 h急性低氧暴露結(jié)束時(shí)AMS評(píng)分≥3者定為AMS。

階段2:恢復(fù)1周后,受試者進(jìn)行3周(2 h/天,4 d/周)間歇性低氧暴露(Intermittent Altitude Exposures,IAE)輔以運(yùn)動(dòng),模擬海拔高度分別為2 500 m(1周)、3 500 m (1周)和4 800 m(1周)?？刂七\(yùn)動(dòng)強(qiáng)度,使受試者在上述低氧環(huán)境下運(yùn)動(dòng)時(shí)的SPO2分別處于90%～92%、< 88%和<75%水平,運(yùn)動(dòng)形式跑步、蹬車(chē)可選。恢復(fù)1周,重復(fù)階段1,LLS量表評(píng)價(jià)AMS。

2.2.2 基因多態(tài)分析

采用Promega公司試劑盒提取基因組DNA。PCRRFLP法解析G894T及4B/4A位點(diǎn)基因型。PCR擴(kuò)增引物應(yīng)用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)完成。

表1 本研究eNOS基因多態(tài)分析引物序列及反應(yīng)條件一覽表Table 1 Primers and PCR-RFLP Conditions for Polymorphism Analysis of eNOS G ene

以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)描述組內(nèi)的AMS評(píng)分水平;基因型及等位基因頻率差異用Mantel-Hanenszeχ2檢驗(yàn),應(yīng)用SPSS 16.0軟件包完成統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性水平定為0.05,非常顯著性水平定為0.01。

2.3 統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

階段1中,受試者的AMS評(píng)分為2.7±2.1,發(fā)生AMS與未發(fā)生AMS受試者的AMS評(píng)分分別為4.3±1.7和1.1±0.9。49.2%(30/61)受試者發(fā)生AMS,評(píng)分值區(qū)間為0～10。受試者G894T及4B/4A位點(diǎn)的基因型和等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P<0.05),不同基因型和等位基因攜帶者AMS的發(fā)生比率見(jiàn)表2。在G894T位點(diǎn),GG、GT和TT基因型攜帶者的AMS評(píng)分分別為4.0±1.4、2.1±1.5和2.8±2.2,不同基因型和等位基因攜帶者的AMS發(fā)生率無(wú)顯著差異;在4B/4A位點(diǎn),BB、4B/4A和AA基因型攜帶者的AMS評(píng)分分別為3.0±2.1、3.0±0.0和2.6±2.1,4A基因攜帶者的AMS發(fā)生率顯著高于4B攜帶者(χ2=5.15,df=1,P<0.05)。

表2 本研究G894T和4B/4A位點(diǎn)不同基因型和等位基因攜帶者AMS的發(fā)生比率一覽表Table 2 AMS Frequencies in Different G enotypes and Alleles at G894Tand 4B/4A Loci

受試者低氧運(yùn)動(dòng)前后的AMS評(píng)分分布參見(jiàn)表3,受試者的AMS評(píng)分為1.4±1.6,發(fā)生與未發(fā)生AMS受試者的AMS評(píng)分分別為4.0±1.2和0.8±0.8,18.7%(9/ 48)的受試者發(fā)生AMS,評(píng)分值區(qū)間為0～6,評(píng)分分布頻率在低氧運(yùn)動(dòng)前、后差異非常顯著(χ2=10.83,df=1, P<0.01)。低氧運(yùn)動(dòng)后,受試者的AMS評(píng)分60.4%(29/ 48)出現(xiàn)下降,27.1%(13/48)不變,12.5%(6/48)出現(xiàn)上升。G894T和4B/4A位點(diǎn)不同基因型和等位基因攜帶者AMS評(píng)分變化分布見(jiàn)表4。在G894T位點(diǎn),低氧運(yùn)動(dòng)后基因型GG、GT和TT攜帶者的AMS評(píng)分分別為2.0± 1.4、0.9±1.1和1.5±1.7,不同基因型和等位基因攜帶者的AMS評(píng)分變化趨勢(shì)間無(wú)顯著差異;在4B/4A位點(diǎn),低氧運(yùn)動(dòng)后基因型BB、4B/4A和AA攜帶者的AMS評(píng)分分別為1.5±1.6、0.0±0.0和0.6±1.3,4A和4B等位基因攜帶者的AMS評(píng)分變化趨勢(shì)差異顯著(χ2=8.14,df =1,P<0.05),且4A攜帶者的AMS評(píng)分均出現(xiàn)下降。

表3 本研究受試者低氧運(yùn)動(dòng)前后AMS評(píng)分分布一覽表Table 3 Distribution of AMS Scores in Subjects before and after Exercise in Hypoxia

表4 本研究G894T和4B/4A位點(diǎn)不同基因型和等位基因攜帶者AMS評(píng)分變化分布一覽表Table 4 Distribution of Changes in AMS Scores of Different G enotypes and Alleles at G894Tand 4B/4A Loci

4 討論與分析

運(yùn)動(dòng)量和爬升速度與AMS的發(fā)生有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),與快速進(jìn)入高原的主動(dòng)參與者相比,被動(dòng)參與者和緩慢進(jìn)入高原的主動(dòng)參與者其AMS發(fā)生率要低得多[1]。Roach等研究了模擬海拔4 300 m低氧暴露初期間歇運(yùn)動(dòng)對(duì)AMS發(fā)生及程度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),受試者在間歇訓(xùn)練時(shí)比在靜息時(shí),無(wú)論AMS發(fā)生率還是其嚴(yán)重程度都較高,其中,86.0%受訓(xùn)者出現(xiàn)AMS,而靜息時(shí)該比例僅為14.0%[1]。Beidleman等研究了低氧環(huán)境下運(yùn)動(dòng)對(duì)SPO2的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在海拔4 300 m環(huán)境中以60%～70% ˙VO2max強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí),受試者SPO2的下降水平與在5 000～5 500 m靜息時(shí)相似,推斷低氧下的運(yùn)動(dòng)可在不增加海拔高度的前提下加重受試者的低氧負(fù)擔(dān)[7]。鑒于上述原因,本實(shí)驗(yàn)采用模擬海拔高度4 800 m暴露6 h的低氧劑量,輔以30 min的恒定負(fù)荷運(yùn)動(dòng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),49.2%的受試者發(fā)生AMS,與海拔3 000 m真實(shí)高原中AMS發(fā)生率相似[4],成功構(gòu)建了適于AMS研究的急性低氧暴露模型。

雖然,研究發(fā)現(xiàn)世居平原人通過(guò)IAE可完全對(duì)AMS免疫[11,12],但Beidleman等的研究首次對(duì)IAE在AMS習(xí)服中的作用進(jìn)行了定量分析[7]。結(jié)果發(fā)現(xiàn),模擬海拔4 300 m環(huán)境下,3周IAE輔以運(yùn)動(dòng)可提高世居平原人的安靜通氣量和SaO2,降低AMS的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。本研究同樣采用3周IAE輔以運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。結(jié)果發(fā)現(xiàn),運(yùn)動(dòng)前、后受試者的AMS評(píng)分由2.7±2.1變?yōu)?.4±1.6,發(fā)生與未發(fā)生AMS的受試者其AMS評(píng)分由4.3±1.7和1.1 ±0.9變?yōu)?.0±1.2和0.8±0.8;受試者的AMS評(píng)分在低氧運(yùn)動(dòng)前、后的分布頻率發(fā)生非常顯著性差異(χ2= 10.83,df=1,P<0.01),發(fā)生AMS的受試者比率顯著減少(49.2%→18.7%),60.4%的受試者AMS評(píng)分出現(xiàn)下降,說(shuō)明本研究方案對(duì)世居平原人適應(yīng)低氧環(huán)境、減輕AMS程度效果明顯,可作為預(yù)防和控制AMS的可行方法。當(dāng)然,我們也注意到本研究中受試者表現(xiàn)出的個(gè)體差異,尤其是12.5%的受試者在低氧運(yùn)動(dòng)后出現(xiàn)AMS評(píng)分的上升,指出了本研究方案的局限性。針對(duì)個(gè)體差異調(diào)整IAE劑量和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度,使運(yùn)動(dòng)方案更具個(gè)性化,這無(wú)疑是未來(lái)AMS防控研究的重點(diǎn),而基因多態(tài)研究似乎為此指明了方向。

世居高原人血漿內(nèi)的NO濃度顯著高于世居平原人,表明其肺部?jī)?nèi)皮具有更高的NO合成水平[3]。eNOS通過(guò)“精氨酸-NOS-瓜氨酸”途經(jīng)合成NO,其基因突變可能影響eNOS的功能及活性,降低NO的生成[11]。研究發(fā)現(xiàn),在G894T位點(diǎn),GG基因型頻率較高者其血清NO水平明顯高于GG基因型頻率較低者,且具有更好的低氧適應(yīng)能力[5]。在4B/4A位點(diǎn),因其多態(tài)性影響了eNOS轉(zhuǎn)錄后mRNA的轉(zhuǎn)錄剪接過(guò)程,導(dǎo)致AA基因型攜帶者的血清NO水平較BB型攜帶者顯著降低了23.0%,從而使4B基因攜帶者表現(xiàn)出更好的低氧適應(yīng)能力[1]。

本研究中,G894 T位點(diǎn)基因型GG、GT和TT在受試者中的比率分別為78.7%、18.0%和3.3%,等位基因G和T的比率分別為87.7%和12.3%,與本實(shí)驗(yàn)室保存的北方漢族人遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(未發(fā)表)及文獻(xiàn)報(bào)道的日本普通人相比差異不顯著[2],與我國(guó)普通漢族人及英國(guó)普通白人相比均有顯著性差異[2],說(shuō)明G894 T突變存在地域和種族差異。在4B/4A位點(diǎn),基因型BB、4B/4A+AA在所有受試者中的比率分別為90.2%和9.7%,等位基因4B和4A的比率分別為91.0%和9.0%,與中國(guó)南方人及文獻(xiàn)報(bào)道的日本人結(jié)果基本一致[1],但等位基因4A的比率非常顯著低于白種人[2],說(shuō)明eNOS基因4B/4A多態(tài)性存在種族差異,但在中國(guó)人中無(wú)地域差異。

本研究首次對(duì)G894T和4B/4A位點(diǎn)多態(tài)性與AMS發(fā)生及其低氧習(xí)服的關(guān)系進(jìn)行了探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在G894T位點(diǎn),不同基因型和等位基因攜帶者的AMS發(fā)生率無(wú)顯著性差異,GG、GT和TT基因型攜帶者的AMS評(píng)分在低氧運(yùn)動(dòng)前、后的變化趨勢(shì)亦不顯著(χ2=0.19,df= 2,P>0.05),說(shuō)明該位點(diǎn)與AMS的發(fā)生和低氧習(xí)服效果無(wú)關(guān),不支持“GG基因型頻率較高者低氧適應(yīng)能力較高”的結(jié)論[5]。究其原因,可能與研究的樣本數(shù)量、種族和地域因素有關(guān),故需要更多、更深入的研究以明確該位點(diǎn)與低氧敏感性的關(guān)聯(lián)。而在4B/4A位點(diǎn),等位基因4B和4A攜帶者的AMS發(fā)生率分別為45.9%和81.8%,后者的AMS發(fā)生率顯著高于前者,表明4A基因是AMS易感性的遺傳學(xué)標(biāo)記,4A基因攜帶者是低氧敏感者,與“4B等位基因攜帶者具有更好的低氧適應(yīng)能力”的說(shuō)法[1]不謀而合。本研究還發(fā)現(xiàn),低氧運(yùn)動(dòng)前、后該位點(diǎn)不同基因型攜帶者的AMS評(píng)分下降趨勢(shì)非常顯著(χ2=12.70,df=2, P<0.01),其中,4A攜帶者的AMS評(píng)分均出現(xiàn)下降,推測(cè)4A攜帶者更易受IAE與運(yùn)動(dòng)的影響,從而具有更好的習(xí)服效果,故可作為未來(lái)AMS研究的重點(diǎn)關(guān)注人群,通過(guò)設(shè)計(jì)適合其特點(diǎn)的低氧運(yùn)動(dòng)計(jì)劃,可有效控制此人群的AMS發(fā)生和程度,從而為AMS防控的個(gè)性化實(shí)施提供了可能。

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Research Related to the Effects of Polymorphisms of eNOS on the Sports Hypoxia Acclimatization to Acute Mountain Sickness

ZHOU Wen-ting,HU Yang,XU Fei,XIN G Ya-wei,YI Long-yan

Objectives:To study the effects of polymorphisms of eNOS at G894 T and 4B/4A loci on incidence and the sports hypoxia acclimation to Acute Mountain Sickness(AMS).Methods:Phase 1:61 students,all male Chinese Han origin lowlanders,were involved in a 6h acute exposure to 4800m altitude-equivalent.Within 30 min of arriving at altitude,volunteers exercised at constant work rate for 20min on a cycle ergometer(70r/min),then rested for the remainder of the 6h altitude exposure.Incidence and severity of AMS symptoms were determined using the LLS.Phase 2:After 1wk of rest,48 volunteers completed an exercise performance testing in a 3wk period of intermittent altitude exposures(IAE)(2h/d,4d/wk)which was undertaken in 2500m,3500m and 4800m,respectively.Restore 1wk,repeat Phase 1.Incidence and severity of AMS symptoms were determined using the LLS.PCR-RFLP was used to determine the genotypes and alleles frequencies of eNOS at G894 T and 4B/4A loci.Results:In Phase 1,49.2%individuals satisfied the diagnostic criteria for AMS.No significant differences of AMS incidence were detected in different genotypes and alleles at G894 T loci,while AMS incidence in 4A allele carriers was remarkably higher than that in 4B carriers.Before and after exercising in hypoxia,the frequency distribution of AMS scores in subjects was significant different.60.4%volunteers won better hypoxia tolerance and 4A allele carriers had better hypoxia acclimation to AMS.Conclusions:Training in IAE is remarkable effective for the hypoxia acclimation to AMS.Allele 4A is one of the genetic marks for the incidence and the hypoxia acclimation to AMS.

polymorphism;acute mountain sickness;incidence f requency;sports hy poxia acclimation

G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

1000-677X(2010)06-0072-04

2010-03-22;

2010-05-12

周文婷(1979-),女,黑龍江哈爾濱人,講師,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)分子生物學(xué)及低氧訓(xùn)練,Tel:(010)62989210, E-mail:springzwt@126.com;胡揚(yáng)(1958-),男,江蘇揚(yáng)州人,教授,博士,博士研究生導(dǎo)師,主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)分子生物學(xué)及低氧訓(xùn)練,Tel:(010)62989208,E-mail: hyyr1@163.com。

北京體育大學(xué),北京100084 Beijing Sport University,Beijing 100084,China.