余宏盛，嚴耀明，茅奇峰，高基民

(1.溫州醫(yī)學(xué)院 浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點實驗室，浙江 溫州 325035；2.深圳第三人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020)

hIL-15-SA雙功能融合蛋白的制備

余宏盛1，嚴耀明2，茅奇峰1，高基民1

(1.溫州醫(yī)學(xué)院 浙江省模式生物技術(shù)與應(yīng)用重點實驗室，浙江 溫州 325035；2.深圳第三人民醫(yī)院，廣東 深圳 518020)

目的：對雙功能融合蛋白hIL-15-SA的發(fā)酵及純化工藝進行研究。方法：采用發(fā)酵罐高密度發(fā)酵hIL-15-SA工程菌，通過鎳柱親和層析及陰離子交換層析純化目的蛋白。免疫印跡分析產(chǎn)物，淋巴細胞增殖試驗以及細胞錨定試驗檢測雙功能融合蛋白hIL-15-SA的生物學(xué)活性。結(jié)果：采用半合成培養(yǎng)基，以3%的接種量，pH值為7.2發(fā)酵可得到濕菌47 g/L，21.15 g/L包涵體。經(jīng)純化后目的蛋白純度為97%。細胞增殖試驗和細胞表面錨定修飾試驗表明，經(jīng)純化復(fù)性的hIL-15-SA融合蛋白具有雙重生物活性。結(jié)論：本研究獲得了高產(chǎn)量、高純度的hIL-15-SA雙功能融合蛋白，為后續(xù)的體內(nèi)生物學(xué)功能研究奠定了基礎(chǔ)。

白細胞介素15；鏈親和素；融合蛋白；中試工藝

利用基因修飾或細胞表面錨定修飾技術(shù)將具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子修飾腫瘤細胞制成腫瘤疫苗是目前研究的熱點。白細胞介素-15（interleukin-15，IL-15)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，其生物學(xué)效應(yīng)與IL-2相似，能刺激T細胞、B細胞、NK細胞的增殖和分化[1-2]。鏈親和素（streptavidin，SA）是由親和素鏈霉菌產(chǎn)生的非糖基化同源四聚體蛋白。它能與生物素非共價緊密結(jié)合，由于鏈親和素可與生物素快速且?guī)缀醪豢赡娴某瑥娊Y(jié)合[3]，以及生物素較容易參入各種生物分子（如蛋白質(zhì)，核酸和脂多糖）中，即生物素化，故鏈親和素-生物素間的強力作用可用于生物醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域[4-5]。我們利用細胞表面易于生物素化和鏈親和素與生物素間特異高效且超強的結(jié)合這兩個特性，研制了hIL-15-SA雙功能融合蛋白，通過鏈親和素與表面已生物素化的腫瘤細胞的高效結(jié)合，將hIL-15錨定在腫瘤細胞表面，制成hIL-15表面錨定修飾的腫瘤細胞疫苗。

本研究在已成功克隆、表達及實驗室小規(guī)模制備hIL-15-SA雙功能融合蛋白的基礎(chǔ)上，采用發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)，鎳柱親和層析及陰離子交換層析純化，初步研究了hIL-15-SA雙功能融合蛋白的中試制備工藝，并對所制備蛋白進行了雙功能的檢測。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株與試劑：大腸桿菌BL21（DE3）、質(zhì)粒pET21a-hIL15-SA-6His均由本實驗室保存；IPTG、氨芐西林、氯霉素、免疫印跡以及MTT檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。Ni-NTA、DEAE層析柱及填料購自美國GE公司，低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購自大連Takara。

1.2 方法

1.2.1工程菌的篩選：將質(zhì)粒pET21a-hIL-15-SA轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布于LB平板（含50μg/mL氯霉素，50μg/mL氨芐霉素），挑取單克隆菌落于5 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)表達。SDSPAGE電泳鑒定，凝膠掃描分析儀分析，取表達量最高的菌株作為發(fā)酵用菌種。

1.2.2hIL-15-SA工程菌的發(fā)酵：將篩選得到的菌株接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制備用于發(fā)酵的二級種子，以3%接種量接種于發(fā)酵罐中，采用半合成培養(yǎng)基成分：20 g/L蛋白胨，40 g/L酵母抽提物，3 g/L硫酸鎂，4 g/L磷酸二氫鈉，12 g/L磷酸氫二鈉，5 mL/L甘油。通過0.1 mol/L NH3·H2O和0.1 mol/L HCl控制發(fā)酵過程的pH值在7.2左右，溶氧量30%，通氣量調(diào)至6～8 L/min。在37 ℃，500 r/min條件下發(fā)酵生產(chǎn)，并添加補料培養(yǎng)基1 L（60 g/L蛋白胨，30 g/L酵母抽提物，6 g/L硫酸鎂，4 g/L磷酸二氫鈉，12 g/L磷酸氫二鈉，40 mL/L甘油），0.3 mmol/L IPTG進行誘導(dǎo)表達。整個發(fā)酵過程持續(xù)11 h（細菌生長期6 h，誘導(dǎo)期5 h）。

1.2.3hIL-15-SA融合蛋白的純化：10000 r/min，4 min離心集菌，細胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，10 mmol/L NaCl pH 8.0)重懸菌體，壓力破碎儀破碎細胞。離心收集包涵體-20 ℃保存?zhèn)溆没蛑苯舆M行純化制備。

①鎳柱親和層析：8 M尿素，4 ℃攪拌過夜溶解包涵體，離心取上清并于0.22μm濾器過濾后用平衡液（6 mol/L urea，5 mmol/L β-ME，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.4）稀釋1倍為上柱前樣品。包涵體首先通過Ni-NTA（30 mL，GE公司）親和層析，通過AKTA純化儀（美國GE）控制流速在1 mL/min。分別用0，30和100 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白。洗脫流速2 mL/min。

②DEAE離子交換層析：將經(jīng)過Ni-NTA純化的目的蛋白，進行DEAE離子交換層析，平衡液（6 mol/L urea，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.4）平衡3～5倍柱床體積，并分別用0、50、70、200 mmol/L NaCl洗脫液洗脫。SDS-PAGE分析鑒定產(chǎn)物。

1.2.4hIL-15-SA融合蛋白的復(fù)性：將純化的融合蛋白hIL-15-SA進行梯度尿素透析復(fù)性，透析液分別為A（4 mol/L urea，0.2 mol/L NaCl，0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2）；B（2 mol/L urea，0.2 mmol/L GSSG，1 mmol/L GSH，20 mmol/L Tris-HCl，10% glycerine pH 8.2）；C（5% glycerine，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2）；D（20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.2）和E（PBS），每種透析液透析8 h，每4 h換液一次，復(fù)性后蛋白經(jīng)非還原性SDS-PAGE以及免疫印跡分析鑒定。

1.2.5Western blot：用12% SDS-PAGE電泳，鑒定表達產(chǎn)物的分子量。SDS-PAGE電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，用含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉2 h。加鼠抗hIL-15一抗4 ℃過夜，用TBST充分清洗3～4次后，加二抗Goat anti-Mouse IgG（1:1000稀釋）孵育1 h，最后，用DAB顯色液作用1～2 min，直至條帶出現(xiàn)。

1.2.6hIL-15-SA雙功能融合蛋白的活性檢測：

①淋巴細胞增殖試驗：取小鼠脾臟，分離鼠淋巴細胞，按每孔1×106/mL細胞密度100μL接種于96孔板。空白組為ConA（5μg/mL）刺激的淋巴細胞。將復(fù)性的hIL-15-SA融合蛋白作倍比稀釋加入培養(yǎng)板中，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔 (以hIL-15標(biāo)準(zhǔn)品作對照)，37 ℃、5% CO2中培養(yǎng)48 h后MTT法檢測依賴于IL-15的淋巴細胞增殖情況。

②細胞表面錨定修飾試驗：取生長狀態(tài)良好的RM-1細胞，酒精滅活調(diào)整細胞數(shù)為5×106/mL，加入Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin使終濃度為1 mg/mL，室溫作用1 h左右；加入經(jīng)復(fù)性的hIL-15-SA融合蛋白置室溫1 h，PBS洗3次；然后加入鼠抗hIL-15抗體于37 ℃孵育1 h，最后加入FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠Ig G二抗1μL室溫避光作用30 min，PBS洗3次后，每管取500μL經(jīng)流式細胞儀檢測分析。

1.2.7hIL-15-SA融合蛋白的含量測定：參見文獻[6]進行。

2 結(jié)果

2.1 工程菌發(fā)酵結(jié)果采用發(fā)酵罐，應(yīng)用半合成培養(yǎng)基，以3%的接種量接種種子菌，發(fā)酵過程中pH值控制在7.2左右，溶氧量30%。工程菌活化6h，IPTG誘導(dǎo)5h。發(fā)酵可得到工程菌濕重47 g/L。見表1、圖1。

表1hIL-15-SA融合蛋白的制備過程

圖1SDS-PAGE鑒定融合蛋白hIL15-SA的表達、純化和復(fù)性

2.2 hIL-15-SA融合蛋白的分離純化包涵體洗滌后經(jīng)過Ni-NTA親和層析，雜蛋白在30 mmol/L咪唑洗脫出，目的蛋白100 mmol/L咪唑濃度下被洗脫，經(jīng)Ni柱純化后，純度達到65.3%（見表1）。同時，收集100 mmol/L咪唑洗脫蛋白再經(jīng)DEAE離子交換層析，最終目標(biāo)蛋白在200 mmol/L NaCl濃度下被洗脫，純度達到97%（見圖1-2）。

圖2免疫印跡鑒定hIL15-SA融合蛋白

2.3 hIL-15-SA雙功能融合蛋白的活性檢測該融合蛋白的生物學(xué)活性包括hIL-15和SA的生物學(xué)活性。經(jīng)ConA刺激后的小鼠脾細胞，在加入復(fù)性后的不同濃度的hIL-15-SA雙功能融合蛋白后，脾細胞的增殖與融合蛋白的濃度呈劑量依賴關(guān)系（見圖3）。同時，用FITC標(biāo)記的二抗，經(jīng)流式細胞儀對錨定在已生物素化的RM-1前列腺癌細胞表面的hIL-15-SA融合蛋白進行檢測，結(jié)果顯示：hIL-15-SA融合蛋白能高效錨定修飾在已生物素化的腫瘤細胞表面，修飾效率為99%（見圖4）。

圖3MTT法檢測hIL-15-SA的淋巴細胞增殖效應(yīng)

圖4細胞錨定率檢測

3 討論

發(fā)酵罐高密度發(fā)酵的目標(biāo)是提高目的蛋白表達量和工程菌的產(chǎn)量。對于hIL-15-SA工程菌，本研究應(yīng)用半合成培養(yǎng)基，以3%的接種量接種種子菌，發(fā)酵過程中pH值控制在7.2左右，溶氧量30%。發(fā)酵可得到工程菌濕重47 g/L，基本能滿足中試制備的需要。重組hIL-15的純化過程分為三步：第一步是進行包涵體的處理以初步純化；第二步是采用鎳柱親和層析純化，蛋白純度達到65.3%；第三步是根據(jù)DNAStar軟件分析，表明蛋白hIL15-SA的等電點5.42，故選取DEAE離子交換法進一步純化，采用陰離子交換層析純化，蛋白的純度達到97%。由于蛋白質(zhì)本身的復(fù)雜性和多樣性，蛋白質(zhì)的復(fù)性方法也各不相同[7-8]，Ward等[9]通過稀釋復(fù)性法將hIL-15緩慢逐滴地加入復(fù)性液中進行復(fù)性，我們通過加入氧化還原對（GSH/GSSG），以增加二硫鍵的正確配對率，從而提高目的蛋白復(fù)性效率。從SDS-PAGE圖中可以看出，經(jīng)復(fù)性后的重組蛋白100 kD左右出現(xiàn)多聚體條帶，同時，經(jīng)依賴于hIL-15的淋巴細胞增殖試驗以及細胞表面錨定修飾試驗，驗證了本研究制備的hIL-15-SA雙功能融合蛋白具有hIL-15和SA的雙重活性。

總之，本研究在成功表達hIL-15-SA融合蛋白的基礎(chǔ)上，進行中試制備研究，最終獲得了高純度的hIL-15-SA雙功能融合蛋白，為后續(xù)動物實驗以及工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

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（本文編輯：吳健敏）

Preparation of hIL-15-SA fusion protein

YU Hongsheng*，YAN Yaoming，MAO Qifeng，GAO Jimin1. *Zhejiang Provincial Key Laboratory for Model Organisms，Wenzhou Medical College，Wenzhou，325035

Objective: To study the fermentation and purification of bifunctional fusion protein hIL-15-SA. Methods:The target protein was orified through the application of affinity chromatography and anion exchange chromatography using high-density fermentation of hIL-15-SA from E.coli. Immunoblotting analysis was used to analyze the hIL-15-SA. Lymphocyte cell proliferation assay and cell-surface-modification assay were performed to analyze the bi-functionalities of the fusion protein. Results:Using the semi synthetic medium，the optimal inoculum size was 3% and pH value was 7.0，47 g/L wet cells and 21.15 g/L inclusion bodies were collected. The purity of target protein reached 97% after purification. Cell proliferation and cell-surface-modification assays demonstrated that the purified and refolded hIL-15-SA fusion protein retained both hIL-15 and streptavidin bioactivities. Conclusion:The work presented an efficient way to prepare hIL-15-SA bifunctional fusion protein with large quantity and good purity， thus will allow us to perform further studies in vivo.

interleukin-15；streptavidin；fusion protein；pilot scale

book=7,ebook=18

Q816

A

1000-2138 (2010)04-0326-04

2010-02-28

浙江省重大科技專項科研基金資助項目（2008C 14082）；浙江省自然科學(xué)基金杰出青年團隊資助項目（R20 80407）；溫州市科技局科研基金資助項目（G20090142）。

余宏盛(1983-)，男，湖北咸寧人，碩士生。

高基民，教授，博士生導(dǎo)師，Email：jimingao@ yahoo.com。