張慕蕊 王 巖馬英智 趙東旭 楊旭芳 李玉林

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春 130021)

逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的靶向人 Slingshot-1L基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞系的建立

張慕蕊 王 巖1馬英智 趙東旭 楊旭芳 李玉林

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的 建立過(guò)表達(dá)該基因的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。方法 采用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法分離、純化 hMSCs。應(yīng)用脂質(zhì)體法將 Slingshot-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLNCX-Slingshot-1L轉(zhuǎn)染 PA 317包裝細(xì)胞,G418篩選,滴度測(cè)定。收集病毒上清感染第 2代 hM SCs,G418篩選,挑選陽(yáng)性克隆,擴(kuò)增培養(yǎng)。結(jié)果 采用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法成功分離、純化了 hMSCs,應(yīng)用 pLNCX-Slingshot-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染 PA 317包裝細(xì)胞,獲得滴度為 5×108CFU/L的病毒上清。收集病毒上清感染 hMSCs,獲得了過(guò)表達(dá) Slingshot-1L基因的hMSCs。結(jié)論 應(yīng)用 Slingshot-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,成功建立了過(guò)表達(dá)該基因的 hMSCs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

逆轉(zhuǎn)錄病毒;穩(wěn)定轉(zhuǎn)染;干細(xì)胞

干細(xì)胞是一類(lèi)具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體,有望成為移植器官的新來(lái)源,然而對(duì)其向不同方向分化的機(jī)制尚不明了。研究表明,機(jī)械應(yīng)力刺激可引起骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(M SCs)和成骨細(xì)胞骨架的解聚和重排,而且M SCs對(duì)機(jī)械力刺激的反應(yīng)比成骨細(xì)胞更敏感〔1〕,表明細(xì)胞骨架在M SCs分化過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用。Slingshot(SSH)是一種特異的肌動(dòng)蛋白解聚因子 (Cofilin)磷酸酶,可使 Cofilin去磷酸化而活化,抑制肌動(dòng)蛋白絲聚合,參與對(duì)細(xì)胞骨架的重排〔2〕,表明 SSH t在干細(xì)胞分化過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì) SSH研究剛剛起步。本文應(yīng)用 SSH-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,獲得高滴度病毒上清,建立過(guò)表達(dá)該基因 hM SCs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,為研究M SCs分化相關(guān)機(jī)制提供有力實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 18～45歲正常成人穿刺骨髓血 5例,均來(lái)自健康自愿者。

1.2 主要試劑和儀器 PA 317及N IH3T3細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLNCX-SSH-1L由王巖教授惠贈(zèng)(SSH-1L基因全長(zhǎng)插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pLNCXMCS多克隆位點(diǎn),末端含有 c-m yc tag)。高糖DM EM培養(yǎng)基、低糖DM EM培養(yǎng)基(美國(guó) Gibco公司),胎牛血清(Hyc lone公司),胰蛋白酶和EDTA(Sigm a公司),Perco ll分離液 (美國(guó) Pharm ia公司); CD 105、CD 73、CD 166、CD 29、CD 45抗體 (BDPharM ingen公司或NeoM arker公司),FITC標(biāo)記二抗 (Sigm a公司),抗人 c-m yc tag抗體 (博奧森生物工程有限公司),抗人 P-cofilin抗體和抗人Cofilin抗體 (美國(guó) Santa Cruz公司 )。引物 hSSH-1L前向:CACAAGCATGCAGGTGATCT,反向:TATGTGCATCCTTCCTGCTG (306 bp);GAPDH前向:GCATCCTCACCCTGAAGTAC,反向: TGGTGCCGCCAGACAGCACT(750 bp)(上海生工合成)。

1.3 hM SCs的分離培養(yǎng) 具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)〔3〕,以 P2和 P4代hM SCs為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.4 病毒包裝及陽(yáng)性克隆篩選 將 PA 317細(xì)胞接種于 6孔板中,至細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)約 80%時(shí)應(yīng)用脂質(zhì)體法將 pLNCX-SSH-1L重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 PA 317細(xì)胞,參考 Invitrogen公司試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。轉(zhuǎn)染 48 h后傳代,用含 800m g/L G418和 10%胎牛血清的 HDM EM培養(yǎng)基篩選。10 d后可見(jiàn)陽(yáng)性克隆,挑選克隆,繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞接近完全融合時(shí)移取上清,即含有病毒的培養(yǎng)液。以未轉(zhuǎn)染的 PA 317細(xì)胞作對(duì)照。

1.5 病毒滴度測(cè)定與計(jì)算 將N IH 3T3細(xì)胞接種于6孔板,收集病毒液,過(guò)濾,制備 6個(gè)系列稀釋梯度的病毒液,加入 6孔板,Polybrene終濃度為 8μg/m l。病毒感染 24 h后,用含500μg/m l G418培養(yǎng)液篩選 1 w。病毒滴度 =最高稀釋度所形成的克隆數(shù) ×稀釋因子。

1.6 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系 將第 2代的 hM SCs接種于 6孔板,從包裝細(xì)胞 PA 317收集的病毒液,過(guò)濾后,將病毒液加至hM SCs,間隔 24 h后再次感染病毒,Polybrene的終濃度為8μg/m l。24 h后更換含 300μg/m lG418培養(yǎng)液篩選,2w后獲得陽(yáng)性克隆。隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆擴(kuò)增培養(yǎng),G418濃度降為150μg/m l。

1.7 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的鑒定

1.7.1 應(yīng)用抗人 c-m yc tag抗體對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光測(cè)定 轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的 hM SCs細(xì)胞鋪細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定,血清封閉,加一抗 (抗人 c-m yc tag抗體),4℃孵育過(guò)夜,加 FITC標(biāo)記的二抗,避光孵育 30m in,PI染核。胞漿中出現(xiàn)綠色熒光為陽(yáng)性反應(yīng)。

1.7.2 應(yīng)用 RT-PCR檢測(cè) SSH-1L的表達(dá)情況 提取轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染 hM SCs細(xì)胞的總 RNA,測(cè)定純度及含量,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,應(yīng)用 SSH-1L和 GAPDH引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后,分別取 PCR產(chǎn)物 5μl,瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀(guān)察。

1.7.3 W estern印跡檢測(cè) Cofilin和 P-cofilin的表達(dá)情況 提取轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染 hM SCs細(xì)胞,裂解后取上清加入凝膠加樣緩沖液,沸水浴上加熱 5m in,上樣,電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交、ECL顯色。

2 結(jié) 果

2.1 hM SCs形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及表面標(biāo)志鑒定 聯(lián)合應(yīng)用 Perco ll (1.073 g/m l)密度梯度離心法和貼壁篩選法,成功分離出 hMSCs。細(xì)胞均為紡錘狀,呈成纖維細(xì)胞樣,匯流時(shí)呈魚(yú)群樣或漩渦狀排列。流式細(xì)胞儀檢測(cè) P4 hM SCs表面標(biāo)志表達(dá)情況, CD 29、CD 73、CD105(間充質(zhì)干細(xì)胞相對(duì)特異性標(biāo)志)和 CD 166 (間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志)為陽(yáng)性,CD 45(白細(xì)胞標(biāo)志)陰性。細(xì)胞成分均一,純度在 96%以上,具有高度的同源性。

2.2 pLNCX-SSH-1L轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞 PA 317 PA 317細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染后,第 5天可見(jiàn)大批細(xì)胞死亡,第 7天陰性對(duì)照組全部死亡,第 10天實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)由數(shù)個(gè)細(xì)胞組成的陽(yáng)性克隆,2 w左右陽(yáng)性克隆接近融合。

2.3 病毒液的產(chǎn)生及病毒滴度的測(cè)定 待陽(yáng)性克隆接近融合,收集 PA 317細(xì)胞的病毒上清,過(guò)濾后,用 N IH3T3細(xì)胞測(cè)定病毒滴度。病毒感染 N IH3T3細(xì)胞 24 h后,用含500μg/m l G418培養(yǎng)液篩選 1w,經(jīng)測(cè)定病毒滴度為 5×108cfu/L。

2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立 收集病毒上清,過(guò)濾后,感染hM SCs。經(jīng) 300μg/m lG418培養(yǎng)液篩選 2w后,獲得 15個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞克隆,隨機(jī)挑選 5個(gè)陽(yáng)性克隆擴(kuò)增培養(yǎng),G418濃度降至150μg/m l。

2.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的鑒定 由于載體上攜帶 c-m yc標(biāo)記,因此用 c-m yc tag抗體對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光測(cè)定,結(jié)果顯示 hM SCs感染率為 90%以上(圖 1)。應(yīng)用 RT-PCR檢測(cè)SSH-1L的表達(dá)情況,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組 SSH-1L的表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖 2)。W estern印跡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組較未轉(zhuǎn)染組P-cofilin的表達(dá)明顯減少 (圖 3),證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染成功。

圖 1 免疫熒光檢測(cè) hM SC s的感染率(×400)

圖2 RT-PCR檢測(cè)SSH-1L的表達(dá)情況

圖3 W estern印跡檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

干細(xì)胞依分化潛能的大小大致可分為 3種類(lèi)型〔4,5〕:①全能干細(xì)胞;②多能干細(xì)胞;③專(zhuān)能干細(xì)胞。而間充質(zhì)干細(xì)胞(M SCs)則屬于多能干細(xì)胞,由于其具有取材容易、擴(kuò)增能力強(qiáng)、具有高度的分化潛能、無(wú)免疫排斥及倫理道德等限制、易于外源基因的轉(zhuǎn)染和表達(dá)等無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)在組織工程學(xué)中被廣泛應(yīng)用,成為細(xì)胞治療和基因治療的理想靶細(xì)胞〔6,7〕。

由于骨髓中M SCs數(shù)量少,因此對(duì)M SCs進(jìn)行有效的體外分離培養(yǎng)擴(kuò)增是后續(xù)工作的關(guān)鍵〔3〕。目前國(guó)內(nèi)外常用的分離劑有 Perco ll和 Fico ll兩種。選用 Perco ll分離液 (1.073 g),即使有少量成纖維細(xì)胞污染,因其是成熟細(xì)胞不能多次傳代,因此可隨著傳代而逐漸消失,從而獲得的M SCs具有高度同源性〔8〕。本文即應(yīng)用了 Perco ll密度梯度離心法聯(lián)合貼壁篩選法獲得了高度同源性的M SCs,純度可達(dá) 96%以上。

此外,M SCs在不同的誘導(dǎo)條件下可分化為多種組織細(xì)胞〔9〕。然而對(duì)其向不同方向分化的機(jī)制尚不明了。研究表明,機(jī)械應(yīng)力刺激可引起M SCs和成骨細(xì)胞骨架解聚和重排,而且M SCs對(duì)機(jī)械力刺激的反應(yīng)比成骨細(xì)胞更敏感,表明細(xì)胞骨架在M SCs分化過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用。SSH可使 Cofilin去磷酸化,同時(shí)激活 Cofilin,進(jìn)而促進(jìn)肌動(dòng)蛋白絲的解聚,抑制肌動(dòng)蛋白絲聚合,因而參與對(duì)細(xì)胞骨架的重排〔10,11〕。

本實(shí)驗(yàn)即應(yīng)用 SSH-1L重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,獲得高滴度的病毒上清,建立過(guò)表達(dá)該基因的 hM SCs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,為研究 SSH對(duì)M SCs分化的影響奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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〔2009-10-15收稿 2009-09-11修回〕

(編輯 曲 莉)

Estab lishm en t of stab le tran sfected hum an m arrow m esen chym a l stem cell line Slingsho t-1L m ed ia ted by retrov ira l

ZHANGM u-Ru i,W ANG Yan,M A Y ing-Zh i,et a l.

O b jective To estab lish stab le transfected hum anmarrow m esenchym al stem cells(hM SCs)line by retroviral vector encoding Slingshot-1L to abtain viral supernatantw ith high viral titers.M ethods hMSCswere isolated and purified from the bonemarrow of hum an by density gradient centrifugation and adhering to the cu lture dishes.The p lasm id pLNCX-Slingshot-1L was transfected into packaging cell PA 317 by lipofectam ine.The transfectantswere selected by G418 and viral titerswere analyzed.V irals supernatantw ere co llected to infect hM SCs in the second passage,selected by G418.Resu lts V irals supernatantw ith high viral titerswereobtained by retroviralvectorencod ing Slingsho t-1L,virals supernatantwere co llected to infect hM SCs,and stable transfected hM SCs linewas estab lished.Con c lusion s The stab le transfected hM SCs line over exp ress Slingsho t-1L m ed iated by retroviralwas estab lished successfu lly.

Retrovirus vector;Stab le transfected cell line;Stem cells

book=330,ebook=21

Q782

A

1005-9202(2010)03-0330-03

國(guó)家863重大專(zhuān)項(xiàng)(2004AA 205020);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目;吉林省科技廳重大項(xiàng)目(20076023)

1 吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院臨床基因診療中心

李玉林(1950-),男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事干細(xì)胞組織工程方面的相關(guān)研究。

張慕蕊 (1981-),女,在讀博士,主要從事細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)研究。

Key Labora tory of Pa thob io logy,M in istry of Educa tion,Schoo l of BasicM ed ica l Sc iences,Jilin Un iversity,Changchun 130021, Jilin,Ch ina