白 靚 金寧一 成 巖 石 毅 王 芳 魯會(huì)軍 南文龍 關(guān) 銘

(吉林大學(xué)藥學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130021)

H5N1及 H7N7亞型禽流感都給人類(lèi)造成了巨大的損失,甚至跨種傳給人類(lèi),造成流感的流行〔1,2〕。老年人與兒童由于免疫力相對(duì)較低,成為潛在高危易感人群。血凝素 (HA)是介導(dǎo)病毒與細(xì)胞表面結(jié)合的主要成分,是流感疫苗研究的重要抗原標(biāo)靶,有研究證明 HA作為DNA疫苗免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可獲得良好的免疫保護(hù)〔3〕。本文旨在構(gòu)建流感雙價(jià) (H5HA/H7HA)DNA疫苗,并在幼倉(cāng)鼠腎 (BHK)細(xì)胞中表達(dá),為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 BHK細(xì)胞株、大腸桿菌 DH5α、真核表達(dá)載體pVAX1、含有 H5HA全閱讀框架質(zhì)粒、含有 H7HA全閱讀框架質(zhì)粒,由中國(guó)人民解放軍基因工程實(shí)驗(yàn)室保存;工具酶、DNA分子量Marker、質(zhì)粒提取試劑盒、克隆載體 pMD18-T購(gòu)自 Takara公司。DNA回收試劑盒購(gòu)自 Q IAGEN公司;脂質(zhì)體 Lipofectatime 2000購(gòu)自 Invitrogen公司;山羊抗兔 IgG熒光抗體購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔抗流感病毒 H5亞型 HA抗體和H7亞型 HA抗體購(gòu)自昆山杰恩生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 H5HA和 H7HA基因的引物設(shè)計(jì) 根據(jù) GenBank中報(bào)道的流感病毒 H5HA(AY6532-00)和 H7HA(AJ704813)cDNA序列,設(shè)計(jì)并合成 2對(duì)特異引物,引物序列如下：H5HA上游引物 A1：5′-GCTAGCCCCGGGGCCGCCACCATGGAGAAAATAGTG CTTCTTCT-3′(含 NheⅠ酶切位點(diǎn));下游引物 A2：5′-CTCGAGGACTCATTAATCGATAAGCTT

CCTCCTCCTCCGGAGCCTCCGCCTCCAATGCAAATTCTGCATTG TAAC-3′XhoⅠ和 ClaⅠ酶切位點(diǎn)及 (G4S)3柔性 linker〕。7HA上游引物 B1：5′-ATCGATAACTTTGACCTGCTCAAGTTG-

ACACTCAAATCCTGGT-3′(含 ClaⅠ酶切位點(diǎn)及口蹄疫病毒 2A蛋白 linker);下游引物 B2：5′-CTCGAGTCAATTGCCGATTGGGTGCTTTTGT-3′(含 XhoⅠ酶切位點(diǎn) )。

1.2.2 H5HA和 H7HA基因 PCR擴(kuò)增 分別以含有 H5HA和H7HA全閱讀框架質(zhì)粒為模版,A1、A2和 B1、B2為引物,PCR擴(kuò)增 H5HA和 H7HA基因。PCR反應(yīng)條件為：94℃變性5 min;94℃變性 30 s,58℃退火 1 min,72℃延伸 90 s,30個(gè)循環(huán);72℃再延伸 10 min。產(chǎn)物經(jīng) 0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建 回收 PCR產(chǎn)物,連接到pMD18-T載體上轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5α,挑取單菌落,大量擴(kuò)增,并用質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖刑崛≠|(zhì)粒用于核酸測(cè)序及酶切鑒定。含目的基因的重組質(zhì)粒命名為 pMD18-T-H5HA和pMD18-T-H7HA。

1.2.4 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 使用 NheⅠ和 XhoⅠ分別雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒 pMD18-T-H5HA和 pVAX1,回收 H5HA片段和載體片段,以 T4DNA連接酶連接后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 DH5α,挑取單菌落,大量擴(kuò)增,提取質(zhì)粒,酶切鑒定,陽(yáng)性質(zhì)粒命名為 pVAX1-H5HA。使用 ClaⅠ和 XhoⅠ分別雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒 pMD18-T-H7HA和 pVAX1-H5HA,回收 H7HA片段和載體片段,以 T4DNA連接酶連接后,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α,挑取單菌落,大量擴(kuò)增,提取質(zhì)粒,酶切鑒定,陽(yáng)性質(zhì)粒命名 pVAX1-H5HA-H7HA。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 BHK細(xì)胞 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 BHK細(xì)胞接種于 6孔板,用 MEM培養(yǎng)基于在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。孵育 18～24 h,至細(xì)胞貼壁,且細(xì)胞覆蓋率達(dá) 70%～80%。重組質(zhì)粒 pVAX1-H5HA-H7HA及 pVAX1空載體分別轉(zhuǎn)染 BHK細(xì)胞,按 Lipofectatime 2000說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的蛋白的檢測(cè) 采用間接免疫熒光法。轉(zhuǎn)染后的 BHK細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出,經(jīng) PBS洗滌后,冷丙酮固定 10～15 min。PBS洗滌 3次,分別加入兔抗禽流感病毒 H5亞型 HA抗體和 H7亞型 HA抗體,37℃反應(yīng) 1.5 h,PBS沖洗 3次,然后與異硫氰酸熒光素 (FITC)標(biāo)記的羊抗兔 IgG熒光抗體反應(yīng) 1.5 h,伊文思蘭染色,置熒光顯微鏡下,波長(zhǎng) 495 nm處觀察和拍照 (加入二抗后操作步驟應(yīng)避光)。

2 結(jié) 果

2.1 H5HA和 H7HA基因的 PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物經(jīng) 0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析,分別可見(jiàn)1 700 bp和 1 100 bp條帶,與H5HA和 H7HA基因預(yù)期大小一致。見(jiàn)圖1。

圖1 H5HA和 H7HA基因的 PCR擴(kuò)增電泳圖

2.2 重組克隆質(zhì)粒的鑒定 重組克隆質(zhì)粒 pMD18-T-H5HA經(jīng) NheⅠ和 XhoⅠ雙酶切后,0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析,可見(jiàn)1 700 bp大小的酶切片段和 2 600 bp大小的載體片段;pMD18-T-H7HA經(jīng) ClaⅠ和 XhoⅠ雙酶切后,可見(jiàn) 1 100 bp大小的酶切片段和 2 600 bp大小的載體片段,與預(yù)期結(jié)果相符。見(jiàn)圖2。

圖2 重組克隆質(zhì)粒的雙酶切鑒定電泳圖

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒 pVAX1-H5HAH7HA經(jīng) NheⅠ和 ClaⅠ雙酶切,經(jīng) 0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析,可見(jiàn) 1 700 bp和 4 200 bp左右大小的條帶;pVAX1-H5HAH7HA經(jīng) ClaⅠ和 XhoⅠ雙酶切,經(jīng) 0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析,可見(jiàn) 1 100 bp和 4 800 bp左右大小的條帶,均與預(yù)期相符,見(jiàn)圖3。通過(guò)對(duì)表達(dá)載體測(cè)序,判定 H5HA和 H7HA均正確插入 pVAX1載體中。

2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中蛋白的表達(dá) 經(jīng)間接免疫熒光檢測(cè),重組質(zhì)粒 pVAX1-H5HA-H7HA在 BHK細(xì)胞中表達(dá)的 H5HA蛋白和H7HA蛋白均能與羊抗兔 IgG熒光抗體反應(yīng),產(chǎn)生明顯的免疫熒光 (綠色),而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒 PVAX1的 BHK細(xì)胞無(wú)熒光,表明H5HA-H7HA融合蛋白獲得表達(dá)。見(jiàn)圖4。

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖

圖4 pVAX1-H5HA-H7HAA轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞后間接免疫熒光檢測(cè)(×200)

3 討 論

DNA疫苗易于構(gòu)建,價(jià)格低廉,使用方便,不僅具有減毒活疫苗既能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答又能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的優(yōu)勢(shì),而且還具有亞單位疫苗的安全性,是目前疫苗研究的熱點(diǎn)〔4～6〕。HA蛋白是介導(dǎo)病毒與細(xì)胞表面結(jié)合的主要成分,是流感最重要的保護(hù)性抗原。以往多數(shù)基因工程疫苗的研究往往只針對(duì)單一的流感病毒亞型,難以符合當(dāng)前流感的變異趨勢(shì)。多價(jià)DNA疫苗在免疫過(guò)程中不僅可以簡(jiǎn)化免疫程序,而且也可以降低免疫成本,同時(shí)引起多種免疫反應(yīng)。南文龍〔7〕等構(gòu)建了人-禽雙價(jià)流感新型 DNA疫苗,其疫苗共表達(dá) H5亞型 HA和 H3亞型主要抗原區(qū) HA1,經(jīng)過(guò)小鼠免疫功毒實(shí)驗(yàn)研究,取得了不錯(cuò)的效果,不僅可以對(duì)相關(guān)流感病毒的攻擊產(chǎn)生保護(hù),而且 HA之間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)免疫干擾現(xiàn)象。

DNA疫苗在進(jìn)行任何體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之前必須首先證明其能夠在體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá),且證明其表達(dá)正確及產(chǎn)物具有活性〔8〕。本研究采用禽流感病毒的 2個(gè)主要亞型,以串聯(lián)形式,將 H5HA與 H7HA一同連接在 pVAX1載體 CMV啟動(dòng)子的下游。在兩個(gè)亞型 HA之間引入不影響蛋白空間構(gòu)象折疊的柔性 linker(G4S)3和具有自裂解功能的口蹄疫病毒 2A linker〔9〕,使兩種不同的蛋白在同一個(gè)啟動(dòng)子下共表達(dá),并分別保持各自的抗原性。采用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)質(zhì)粒載體 pVAX1-H5HA-H7HA中 H5HA和 H7HA基因在 BHK細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)情況。結(jié)果顯示兩種目的蛋白可以分別與相應(yīng)的血清反應(yīng),表明抗原性良好。其在體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性有待進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究為雙亞型流感DNA疫苗的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 Sims LD,Domenech J,Benigno C,et al.Origin and evolution of highly pathogenic H5N1 avian influenza in Asia〔J〕.Vet Rec,2005;157(2)：159-64.

2 Malik Peiris JS.Avian influenza virues in humans〔J〕.Rev Sci Tech,2009;28(1)：161-73.

3 Johansson BE,Brett IC.Changing perspective on immunization against influenza〔J〕.Vaccine,2007;25(16)：3062-5.

4 Derk RR,DeW itt CM,Donnelly JJ,et al.Characterization of humoral immune responses induced by an influenza hemagglutinin DNA vaccine〔J〕.Vaccine,1997;15(1)：71-8.

5 Kadowaki S,Chen Z,Asanuma H,et al.Protection against influenza virus infection in mice immunized by administration of hemagglutinin-expressing DNAs with electroporation〔J〕.Vaccine,2000;18(25)：2779-88.

6 Wang SX,Taaffe J,Parker C,et al.Hemagglutinin(HA)proteins from H1 and H3 serotypes of influenza A viruses require different antigen designs for the induction of optimal protective antibody responses as studied by codon-optimized HA DNA vaccines〔J〕.J Virol,2006;80(23)：11628-37.

7 南文龍,金寧一,魯會(huì)軍,等 .人-禽雙價(jià)流感新型 DNA疫苗構(gòu)建及免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)科學(xué) C輯：生命科學(xué),2009;39(6)：534-41.

8 Jimenze-Cavero MA.Molecular cloning,expressing and immunological analysis of capid precursor polupeptide(p1)from s wing vesicular disease virus〔J〕.Virus Res,1998;57(6)：763-70.

9 Chinasamy D,Milsom MD,Shaffer J,et al.Multicistronic lentiviral vector containing the FMDV 2A cleavage factor demonstrate robust expression of encoded genes at limiting MOL〔J〕.J Virol,2006;3(1)：14.