宋 敏，于季軍，楊丹彤，孟景會(huì)

（1.河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 開(kāi)封 475004；2.開(kāi)封市第二人民醫(yī)院，河南 開(kāi)封 475002；3.山東省優(yōu)生技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250002；4.廣東嘉應(yīng)制藥股份有限公司，廣東 梅州 514021）

菟絲子為旋花科一年生寄生性蔓草菟絲子（Cuscu ta ch inensis L am.）或大菟絲子（C.j ap on ica Choisy）的成熟種子，具有補(bǔ)陽(yáng)益陰、固精縮尿、明目止瀉的功效[1]。黃酮類(lèi)物質(zhì)是菟絲子的主要活性成分，其中以槲皮素和山萘酚為代表[2]，在免疫、心血管方面有顯著作用，在抗氧化、抗衰老方面也有一定作用，有試驗(yàn)報(bào)道菟絲子還具有促進(jìn)皮膚細(xì)胞分化的功能[3]。菟絲子醇提水溶液皮下注射小白鼠半數(shù)致死量為2.465 g/kg，30～40 g/kg灌胃并不出現(xiàn)中毒癥狀，是一味溫而不燥、補(bǔ)而不滯、平補(bǔ)肝腎的良藥。但目前菟絲子的保肝功能研究較少，僅見(jiàn)宋敏報(bào)道[4]。筆者通過(guò)腹腔注射10%四氯化碳/橄欖油建立小鼠慢性肝損傷模型并對(duì)模型動(dòng)物灌服菟絲子黃酮來(lái)探討菟絲子黃酮對(duì)小鼠慢性肝損傷的保護(hù)作用。以期為利用菟絲子植物資源作為保肝藥物的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小白鼠，購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心，體重18～22 g，雄性。

1.1.2 試劑及藥品 菟絲子（Semen cuscutae flavonoids） 購(gòu)自開(kāi)封市中醫(yī)院；ALT、AST、SOD、MDA、GSH檢測(cè)試劑盒、蘇木精、伊紅染液（南京建成生物工程研究所）；蘆?。ㄖ袊?guó)藥品生物制品鑒定所）；四氯化碳、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、石油醚、95%乙醇、無(wú)水乙醇、二甲苯、甲醇、橄欖油等藥品均為分析純（河南大學(xué)設(shè)備科）。

1.1.3 儀器設(shè)備 721分光光度計(jì)、高速臺(tái)式離心機(jī)、電子分析天平、電熱恒溫水浴鍋、索氏提取器。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥品制備 取菟絲子干燥種子，粉碎。石油醚去脂，用8倍體積95%乙醇90℃提取6 h?；厥找掖?，定容。以燥至恒重的蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，500 nm處測(cè)定吸收度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。測(cè)定提取液中菟絲子黃酮濃度。經(jīng)測(cè)定，菟絲子干燥種子黃酮含量為1%，將樣品制成終濃度5.5 mg/mL以備后用。

1.2.2 動(dòng)物處理 將45只小鼠隨機(jī)分成3組，每組15只。對(duì)照組：自由飲水取食；模型組：腹腔注射10%CCl4/橄欖油10 mL/kg、每周2次、自由飲水取食；藥劑組：腹腔注射10%CCl4/橄欖油10 mL/kg、每周2次、自由飲水取食，按10 mL/kg體重灌服5.5 mg/mL菟絲子黃酮。試驗(yàn)期間喂正常顆粒飼料，不限食量。連續(xù)4周后停止給藥。

1.2.3 樣品處理及生化指標(biāo)的檢測(cè) 最后一次注射藥物后3組動(dòng)物禁食，正常飲水，16 h后，眼球采血，采血后立即將裝有血樣的試管放入37℃恒溫箱中靜置3 h，1 500 r/min分離心15 min，分離血清，血清分裝貯存于4℃冰箱中待分析，測(cè)定方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。肝臟組織用10%甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，光學(xué)樹(shù)脂封片，光鏡下觀(guān)察肝臟組織病理學(xué)改變。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況

試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)好，毛發(fā)有光澤，食欲佳，排便正常。菟絲子水煎劑組、菟絲子大劑量黃酮組、菟絲子小量黃酮組及模型組在試驗(yàn)初期外觀(guān)相似，毛發(fā)無(wú)光澤，食欲差，體重增長(zhǎng)緩慢，多數(shù)小鼠出現(xiàn)腹瀉。但隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮組小鼠狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)。解剖學(xué)觀(guān)察，空白組小鼠肝臟表面無(wú)脂肪附著。本試驗(yàn)選取肝體比作為測(cè)定指標(biāo)，即（全肝濕重/體重）×100。正常時(shí)各肝臟與體重的比值比較恒定。動(dòng)物染毒后，受損肝臟重量可以發(fā)生改變，故肝體比也隨之而改變。肝體比增大，表示臟器充血、水腫或增生肥大等；肝體比減小，表示臟器萎縮及其他退行性改變。經(jīng)t檢驗(yàn)分析表明，模型組小鼠的肝體比明顯高于對(duì)照組（p<0.01），肝臟表面附著脂肪。菟絲子黃酮組小鼠肝體比較模型組降低顯著（p<0.01），肝臟表面附著少量脂肪但未見(jiàn)點(diǎn)狀壞死。

表1 小鼠的肝體比

2.2 各組小鼠ALT、AST檢測(cè)結(jié)果

各組小鼠AST、ALT檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，模型組小鼠AST、ALT水平明顯升高，經(jīng)t檢驗(yàn)分析表明兩者差異極顯著（p<0.01），菟絲子黃酮藥劑組能夠降低血清AST、ALT水平，效果顯著（p<0.01）。

表2 小鼠的ALT及AST的活性

2.3 各組小鼠SOD、MDA、GSH檢測(cè)結(jié)果

各組小鼠SOD、MDA、GSH檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，模型組小鼠SOD、GSH水平明顯降低，經(jīng)t檢驗(yàn)分析表明兩者差異極顯著（p<0.01），MDA水平明顯升高（p<0.01）。菟絲子黃酮藥劑組能夠提高SOD、GSH水平，降低MDA水平，效果顯著（p<0.01）。

表3 小鼠的SOD、MDA、GSH的活性

2.4 肝臟的病理學(xué)檢測(cè)

對(duì)照組小鼠肝臟被膜光滑，呈紅褐色，質(zhì)地均勻。模型組小鼠肝臟被膜不光滑并有少量脂肪附著，肝臟顏色較對(duì)照組小鼠暗淡，質(zhì)地較硬。菟絲子黃酮藥劑組肝臟顏色較對(duì)照組小鼠暗淡，但顏色明顯比模型組深，質(zhì)地較硬。顯微結(jié)構(gòu)顯示，空白組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列、肝竇結(jié)構(gòu)規(guī)整，肝細(xì)胞核圓形，胞質(zhì)紅染，肝細(xì)胞無(wú)變性、壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維增生。模型組多數(shù)肝小葉正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝細(xì)胞變性壞死明顯，表現(xiàn)為脂肪變性和細(xì)胞水腫，胞漿疏松化、核深染，伴有點(diǎn)狀、灶狀程度不等、范圍不一的肝細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)擴(kuò)大，有粗細(xì)不均的纖維束從匯管區(qū)伸出，纖維增生。菟絲子黃酮藥劑組肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，少數(shù)肝細(xì)胞壞死，肝小葉中央?yún)^(qū)及部分門(mén)管區(qū)可見(jiàn)輕度脂肪變性，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝纖維化程度有不同程度的減輕。這說(shuō)明菟絲子黃酮藥劑組有明顯的保肝作用。

3 討論

CCl4是經(jīng)典的藥物性肝損害造模藥物，CCl4進(jìn)入機(jī)體，在肝臟經(jīng)微粒體細(xì)胞色素P-450激活后，產(chǎn)生活潑的三氯甲基自由基（CCl3·），三氯甲基自由基可攻擊細(xì)胞膜上的磷脂分子，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，最終導(dǎo)致生物膜破壞，肝細(xì)胞壞死[5-6]。由于肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞膜通透性增加，ALT、AST大量滲入血液使血中酶活增高[7]。所以血清中ALT、AST這兩種轉(zhuǎn)氨酶活性的增高在一定程度上反映了肝細(xì)胞損害和壞死的程度。

SOD是細(xì)胞內(nèi)天然的氧自由基清除劑，而MDA則是氧自由基與細(xì)胞表面不飽和脂肪酸反應(yīng)（脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)）的產(chǎn)物[8]。SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。小鼠腹腔注射CCl4導(dǎo)致慢性肝損傷，過(guò)量的氧自由基產(chǎn)生于肝細(xì)胞并對(duì)其損傷，會(huì)引起SOD水平的降低和MDA水平的升高。

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶。它特異的催化GSH對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，可以起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。小鼠腹腔注射CCl4導(dǎo)致慢性肝損傷，細(xì)胞膜表面發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，會(huì)引起GSH水平的降低。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，菟絲子黃酮能夠降低血清中ALT、AST、MDA水平，提高血清中SOD、全血中GSH水平，即能夠有效地保護(hù)肝細(xì)胞，使肝細(xì)胞損傷程度降低，減少纖維化。其作用機(jī)制可能是通過(guò)清除氧自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、穩(wěn)定肝細(xì)胞膜而達(dá)到的。

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