王小紅
(南通農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院,江蘇 南通 226006)
生物技術(shù)的迅速發(fā)展為加快玉米育種進程開辟了新途徑,玉米體細胞培養(yǎng)技術(shù)不斷取得進展。利用玉米不同器官作外植體進行組織培養(yǎng)的研究顯得格外重要。研究建立有效的組織培養(yǎng)系統(tǒng),從中獲得大量再生植株是玉米育種工作的首要前提。自1975年Green首次從玉米未成熟胚培養(yǎng)出愈傷組織,并成功地獲得了再生植株以來,玉米幼胚培養(yǎng)技術(shù)有了快速發(fā)展。雖現(xiàn)在幾乎能從玉米各個部位誘導出愈傷組織,但幼胚是最易誘導也是使用最多的外植體。誘導玉米幼胚產(chǎn)生胚性愈傷組織及胚性愈傷組織分化受諸多因素的影響,包括基因型、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件、幼胚大小等。筆者選用抗性好、適宜本地種植的玉米自交系幼胚進行了外植體的愈傷組織誘導研究,旨在建立具有胚性的愈傷組織培養(yǎng)體系,為玉米遺傳轉(zhuǎn)化提供受體材料。
1.1.1 供試材料 供試材料為玉米自交系515、齊319、魯原 341、502,海南種植。
1.1.2 試劑與儀器 抗生素、生長素、封口膜等購于上海生工。烘箱、離心機、超凈工作臺、氣候箱等由南通農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院生物技術(shù)實驗室提供。
1.1.3 培養(yǎng)基 (1)MS誘導培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+0.5 g/L Pro、40 g/L 蔗糖、0~2.5 mg/L 2,4-D 、0.5 mg/L氨基苯甲酸、0.5 mg/L泛酸鈣、0.25 mg/L核黃素;(2)MS繼代培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基+1.0 mg/L 、0.5 g/L Pro、30 g/L 蔗糖;(3)分化培養(yǎng)基:MS 培養(yǎng)基+30 g/L蔗糖、0~2 mg/L 6-BA ;(4)生根培養(yǎng)基:N 6 培養(yǎng)基+20~30 g/L 冰糖、5 g/L 活性炭、1 mg/L 6-BA 。
1.2.1 幼胚的預處理 取授粉后11~13 d的玉米果穗,剝?nèi)プ钔鈨蓪影~。用70%乙醇噴灑苞葉表面,然后剝?nèi)訉影~,當剩最后一層時,再用70%乙醇噴灑苞葉表面,立刻將果穗轉(zhuǎn)入超凈工作臺。去掉苞葉和花絲,用解剖刀削去子粒頂部2/3胚乳,用鑷子從中上部挑出幼胚(幼胚大小最適0.8~2.0 mm)。盾片朝上放入誘導培養(yǎng)基,避光、27℃下誘導出愈傷組織。
1.2.2 玉米愈傷的繼代培養(yǎng) 誘導出的長勢好的愈傷組織夾成2~3 mm大小的塊,在繼代培養(yǎng)基培養(yǎng),約10~12 d繼代一次,進行愈傷組織的增殖。培養(yǎng)溫度為28℃,光照10~12 h/d,光照強度800~1 000 Lx,日光燈照明。
1.2.3 愈傷組織再分化及植株的再生 將抗性的愈傷挑入分化培養(yǎng)基中光照培養(yǎng),再生植株。當再生苗在三角瓶中長到6~9 cm高時,將其移到小的花盆中(下層為滅菌的壤土,上層為蛭石),每天澆l/10 MS營養(yǎng)液,并套袋保濕,在大棚中培養(yǎng)10 d左右,移栽到土壤中。
1.2.4 影響愈傷組織誘導的各因素 (1)胚齡和基因型對胚性愈傷組織誘導率的影響:分別取授粉后8、9、10、11、12、13 d(海南地區(qū)夏播)的玉米幼胚,幼胚長度約在1~3 mm左右,基因型分別為齊319、515、魯原 341、502,在加有 0.5 m g/L 2,4-D 的誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng),在20 d左右統(tǒng)計胚性愈傷組織的誘導率,并對胚齡和基因型兩因素進行隨機試驗方差分析。(2)2,4-D濃度對胚性愈傷組織誘導的影響:取授粉10 d的齊319、魯原34的玉米幼胚,在 2,4-D 濃度為:0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L 的誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng),25 d后統(tǒng)計胚性愈傷組織塊數(shù)。
2.1.1 胚齡對胚性愈傷組織誘導率的影響 如表1所示,胚齡9 d的魯原341胚性愈傷組織誘導率最高,可以達到98.5%,其他基因型授粉10 d左右的幼胚最高。13 d的幼胚胚性愈傷組織誘導率很低,最高的齊319也只有76.8%。從表1可以看出,10 d胚齡的幼胚誘導率最高,平均達到88.09%,13 d的最低,平均只有65.90%。胚齡對于胚性愈傷組織的誘導率差異比較顯著。從技術(shù)的可操作性和培養(yǎng)性狀來講,10 d左右的幼胚一般在1.2~1.5 mm左右,胚性愈傷組織誘導率高,幼胚容易從雌穗上剝離,實驗可操作性強。胚齡較大的幼胚在誘導培養(yǎng)基上容易萌發(fā),誘導出的愈傷組織發(fā)粘、胚性差、不易繼代。
表1 不同基因型玉米幼胚不同生長天數(shù)下的胚性愈傷組織誘導率 (%)
2.1.2 基因型對胚性愈傷組織誘導率的影響 從表1的數(shù)據(jù)和分析中可以看出齊319的胚性愈傷組織誘導率平均最高,達到87.08%,502的最低,只有61.44%。其中502誘導出的愈傷組織大部分發(fā)粘,H型胚性愈傷組織少,不易繼代培養(yǎng);齊319與魯原341誘導的H型愈傷組織多,松脆,淡黃色,胚性好。說明不同的基因型在相同2,4-D濃度的培養(yǎng)基上誘導,胚性愈傷組織誘導率有顯著差異,由此看出基因型是影響玉米遺傳轉(zhuǎn)化的一個重要因素。
2.1.3 2,4-D濃度對胚性愈傷組織誘導的影響2,4-D對愈傷組織的誘導和生長非常有效,在組織培養(yǎng)中一般用其作為培養(yǎng)基中的生長激素。培養(yǎng)基中2,4-D的濃度對玉米愈傷組織的誘導影響極大。如表2所示,齊319在1.0 m濃度上胚性愈傷組織誘導率最高,達到97.8%,而魯原341在0.5 mg/L上誘導率最高,達到98.5%??梢?,4-D濃度對玉米幼胚的胚性愈傷組織誘導率有很大影響,而不同基因型的最大誘導率所需的2,4-D濃度也不相同。為防止2,4-D濃度過高影響玉米愈傷組織的分化,誘導培養(yǎng)基的2,4-D濃度最高不超過2 mg/L。
表2 2,4-D濃度對愈傷組織誘導率的影響 (%)
2.2.1 繼代時間的影響 愈傷組織在繼代的前2~3 d,處于靜止生長期,生長緩慢,4~5 d后愈傷組織明顯膨大,周緣開始長出米粒狀的新愈傷組織,此時生長進入對數(shù)生長期,10~12 d以后,愈傷組織生長開始緩慢,進入延遲生長期,此時要進行繼代培養(yǎng)。否則愈傷組織容易失去胚性,不易分化成苗。繼代時間的長短是愈傷組織能否長期保持胚性的關(guān)鍵因素之一,在對數(shù)生長期或?qū)?shù)生長后期進行繼代,能夠長時間保持愈傷組織的胚性。繼代時愈傷組織夾成2~3 mm的小塊轉(zhuǎn)移到新的繼代培養(yǎng)基上,夾取顏色鮮黃、較脆的胚性愈傷組織進行繼代較好。
2.2.2 生長素濃度對繼代的影響 繼代培養(yǎng)基的2,4-D濃度一般為1 mg/L,愈傷組織生長旺盛,且可以長期保持胚性。2,4-D濃度過高會使愈傷組織受到傷害,同時也可以增加無性系變異2,4-D濃度過低愈傷組織生長緩慢,長勢不好,不利于繼代。
2.3.1 AgNO3對玉米再生率的影響 試驗表明,在培養(yǎng)基上添加8 mg/L AgNO3可以明顯提高玉米再生率。當AgNO3濃度高于20 mg/L時,愈傷組織多數(shù)出現(xiàn)只長根,不長芽現(xiàn)象,或者只是產(chǎn)生一些胚狀根,雖然有綠點,但是無法形成真正的綠苗。
2.3.2 MET對玉米再生苗的影響 由于三角瓶中濕度大,光線弱,培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富,玉米再生苗在基本培養(yǎng)基上生長快、莖稈細、節(jié)間長、葉片發(fā)黃、植株弱小、根系不發(fā)達、移栽后不易成活。試驗發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加2 mg/L MET可以有效抑制玉米苗徒長,苗粗壯健康,節(jié)間縮短,葉色發(fā)綠,根系發(fā)達,移栽后容易成活。
(1)在培養(yǎng)基的選擇上,主要采用MS和N6培養(yǎng)基,二者對于不同品種和品系玉米愈傷組織的植株再生影響不同。對于誘導產(chǎn)生出胚性愈傷組織,MS比N6效果好,若由幼胚直接再生植株,則N6培養(yǎng)基效果更好,MS與N6的主要區(qū)別在于氮源的形式不同。此外激素的選擇也影響愈傷組織的生成,2,4-D是影響組織脫分化的關(guān)鍵因素,較高濃度的2,4-D誘導外植體脫分化產(chǎn)生愈傷組織,降低或不加2,4-D愈傷組織才能分化出完整的胚狀體,并再生出小植株。在誘導愈傷組織和繼代過程中,培養(yǎng)物有三種類型:Ⅰ型:結(jié)構(gòu)緊密,不易分開,這種愈傷組織很容易分化成芽和根或胚狀體,但不易繼代培養(yǎng)。Ⅱ型:結(jié)構(gòu)松軟,白色透明,很容易繼代培養(yǎng),但喪失了分化能力。Ⅲ型:介于Ⅰ型和Ⅱ型之間,具有明顯的顆粒狀結(jié)構(gòu),白色或淺黃色,具有分化胚狀體的能力,而且又能繼代培養(yǎng)。因此,把第三種類型篩選出來,才能使繼代培養(yǎng)的愈傷組織保持它的分化能力。
(2)根據(jù)玉米愈傷組織的類型,可以挑選合適的愈傷組織進行分化培養(yǎng)。愈傷組織分化是不整齊的,這是因為在愈傷組織繼代中并沒有進行同步培養(yǎng)有關(guān)。分化率的高低與基因型和培養(yǎng)基有很大的關(guān)系,而在繼代中表現(xiàn)好的自交系其分化率也相對較高。但不同的基因型材料還應進一步作不同培養(yǎng)基的試驗,以提高愈傷組織的分化率。所有材料在繼代過程中都有分化現(xiàn)象出現(xiàn),有的出現(xiàn)綠點,應視愈傷組織生長情況及時調(diào)整激素濃度及比例,如分化明顯,根毛及芽較多應提高2,4-D濃度,降KT或BA濃度,反之則相反。但2,4-D濃度不宜超過4 mg PL,也不能在高濃度2,4-D條件下繼代時間過長,一旦受到此影響,材料的分化能力就很難恢復。
(3)本實驗所用的4個材料均能誘導出愈傷組織,表明玉米幼胚愈傷組織的誘導具有普遍性,但各個材料問的誘導率差別較大,實驗表明基因型對玉米愈傷組織的產(chǎn)生有著重要影響。Spencer等的研究發(fā)現(xiàn),玉米的基因型、幼胚大小及植株的發(fā)育狀態(tài)是影響玉米幼胚培養(yǎng)及植株再生的重要因素,其中玉米的基因型影響特別大。實驗也表明濃度對愈傷組織的誘導和生長非常有效,這與王雷等在誘導玉米愈傷組織時的發(fā)現(xiàn)一致。中國科學院上海植生所黃璐等認為,2,4-D雖然可以起到誘導的作用,但其對外植體及愈傷組織的傷害作用較大,故誘導時所采取的濃度不易過大,以減少組織培養(yǎng)中的無性系變異。
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