王 蒙 ，李純厚 ，戴 明 ，韋芳三 ，周巖巖 ，楊慧英，胡維安，楊 進(jìn)

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖生態(tài)與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)，上海 201306）

牟氏角毛藻（Chaetoceros miielleri）隸屬硅藻門（Bacillariohyta）盒形藻目（Biddulphiales）[3]，其體積小、細(xì)胞壁薄、耐高溫、繁殖速度快、抗污染能力強(qiáng)，多數(shù)單個(gè)生活，有時(shí)2～3個(gè)組成群體。其所含營養(yǎng)豐富，適于蝦類、蟹類以及泥蚶、牡蠣等貝類幼體攝食和消化[4]，且在溫度為10～39℃環(huán)境下均能生長繁殖，是海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的良好餌料生物。與其他單胞藻相比，牟氏角毛藻藻體內(nèi)含有大量的脂肪酸、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，近年來引起人們的廣泛研究[5-9]。

蔣霞敏[10]研究指出，外界培養(yǎng)條件的變化（如養(yǎng)分、光照、溫度、鹽度等）均會(huì)影響微藻細(xì)胞的生長及其脂肪酸的含量與組成。豐富的碳源有利于積累更多的油脂[11]，C/N比對(duì)微藻油脂合成也有顯著影響[12]。CO2的來源廣泛，利用CO2促進(jìn)微藻細(xì)胞的生長，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。光合作用以CO2作為基質(zhì)消耗，引起pH變化，采用添加大量的NaHCO3會(huì)導(dǎo)致海水中多種重要離子的沉淀[8,13-14]并使生產(chǎn)成本提高。5%濃度的CO2對(duì)微藻的光合作用特征及固碳機(jī)制的影響，已有廣泛的研究[8,15-16]。CO2及CO2通入方式對(duì)微藻生長速度及細(xì)胞密度的影響近年來也有報(bào)道，但通入的CO2與空氣的比例對(duì)微藻相對(duì)生長率和總脂含量百分比的研究卻很少。本文旨在探索牟氏角毛藻作為生物燃料的原材料的可行性，通過控制培養(yǎng)過程中通入的CO2/空氣比值的大小，刺激藻體內(nèi)乙酰-COA（Acetyl-COA）和NADPH的生產(chǎn)，使其積累更多的油脂，以提高牟氏角毛藻的總脂含量。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2009年9～11月在南海水產(chǎn)研究所深圳實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，牟氏角毛藻藻種由中國水產(chǎn)科學(xué)院南海水產(chǎn)研究所水產(chǎn)種質(zhì)資源與養(yǎng)殖技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室提供。試驗(yàn)用藥品全部為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)用水、培養(yǎng)液配方和培養(yǎng)容器 培養(yǎng)用海水全部取自深圳市楊梅坑海域，鹽度約為30.6，加入消毒淡水將鹽度調(diào)至20。依次經(jīng)遮光沉淀，過濾棉、脫脂棉、300目篩網(wǎng)過濾，煮沸消毒。以消毒海水為基礎(chǔ)，加入一定的營養(yǎng)鹽配成培養(yǎng)液，基礎(chǔ)培養(yǎng)液成分[17]見表1。在本試驗(yàn)中將培養(yǎng)液中NaHCO3的濃度調(diào)為5.75 g/L，培養(yǎng)容器為Corning 1 L扁形玻璃培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)液體積為800 mL。試驗(yàn)前用1%稀鹽酸溶液浸泡、洗滌、120℃高溫消毒1 h，冷卻備用。

表1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方 （g/L）

1.2.2 培養(yǎng)方法與日常管理 試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)梯度的CO2/空氣比值，分別為A處理，1/5；B處理，1/10；C 處理，1/15；D 處理，1/20；E 處理，1/25；以不通氣體作為空白對(duì)照組。試驗(yàn)時(shí)采用單種培養(yǎng)，試驗(yàn)藻在85-2恒溫磁力加熱攪拌器上培養(yǎng)，攪拌速度約200 r/min；溫度設(shè)定為26℃；采用6只40 W燈管并排放置的方法全天24 h光照，光照強(qiáng)度約為4 000 lx（上海市嘉定學(xué)聯(lián)JD-3照度計(jì)）；培養(yǎng)液鹽度為20，pH控制為7.8～8.5。用直徑5 mm的玻璃管勻速通入CO2與空氣的混合氣體，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行。每24 h從培養(yǎng)瓶中取出約2/3倒入5 L塑料桶中繼續(xù)培養(yǎng)備用，然后再加入新的培養(yǎng)液，即半連續(xù)培養(yǎng)。

1.3 計(jì)數(shù)

每日上午8點(diǎn)到10點(diǎn)擴(kuò)藻，擴(kuò)藻前后分別取樣一次，采用KB-K-25血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，每個(gè)樣計(jì)數(shù)2～3次，取平均值并分別計(jì)算牟氏角毛藻每個(gè)梯度、每個(gè)平行培養(yǎng)瓶擴(kuò)前擴(kuò)后的細(xì)胞密度，計(jì)算相對(duì)生長率。

1.4 采收與提取

待塑料桶中的牟氏角毛藻生長至指數(shù)生長期末期[18]（此時(shí)脂肪酸積累程度最高），用離心機(jī)（上海安亭LXJ-IIB）4 500 r/min離心15 min濃縮藻液，棄去上清液后的藻泥用消毒淡水清洗2～3次，并將藻泥置于鼓風(fēng)干燥箱中45℃干燥至恒重備用。參照文獻(xiàn)[19]，將干燥后的藻泥稱重并用脫脂棉包好裝入卷好的濾紙筒，再將濾紙筒放入提取筒中，連接好接收瓶和冷凝管，并用鐵架臺(tái)固定。加入無水乙醚至接收瓶容積的2/3，60℃水浴加熱，索氏提取法提取體內(nèi)的粗脂肪。提取后的濾紙筒烘干至恒重，準(zhǔn)確稱量提取前后干濾紙筒的重量，兩者之差即為粗脂肪的重量，進(jìn)而計(jì)算出該梯度條件下粗脂肪的含量。只需更換濾紙包即可進(jìn)行下一次測定，可連續(xù)操作，方法簡單經(jīng)濟(jì)，能得到較好的平行結(jié)果。

一般來說,對(duì)同一量子態(tài)進(jìn)行測量時(shí),正定算子值測量之矩陣的階僅是投影測量之矩陣的階的一半[7-8,43]。這表明:就同一量子任務(wù)而言,采用正定算子值測量的協(xié)議比采用投影測量的協(xié)議更簡單且易于實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)。本節(jié),我們通過用正定算子值測量代替上節(jié)中的投影測量U1,達(dá)到改進(jìn)上述方案的目的。

1.5 計(jì)算方法

1.5.1 相對(duì)生長率 計(jì)算公式為：

其中Κ代表生長率，Nt為試驗(yàn)進(jìn)行到t天擴(kuò)藻前的細(xì)胞密度，N0為t0天時(shí)擴(kuò)藻后的細(xì)胞密度，t0＜t。

1.5.2 總脂含量百分比 計(jì)算公式為：

其中P代表總脂含量百分比，n代表粗脂肪總重，m代表樣品藻的干重。

1.5.3 總脂日增量 假設(shè)樣品藻初始干重為a g，P代表總脂含量百分比，且在相同生長條件下P不變，則生長一天后，藻液中的藻干重為2Ka g，藻中粗脂肪的總重量為2Ka·Pg，所以總脂日增量的計(jì)算公式為：

1.6 保種

本文采用的是固定化[20]保存方法，方法如下：稱取2.5 g海藻酸鈉，溶入100 mL蒸餾水中，并加入2 g氯化鈉，攪動(dòng)加熱至成為均勻的粘稠狀膠體停止加熱，此即為固定化所需的海藻酸鈉凝膠溶液。將濃縮后的藻細(xì)胞懸浮液與海藻酸鈉凝膠溶液按1∶4的比例充分混勻，制成膠－藻混懸液；取20 mL注射器、9號(hào)針頭吸取混懸液，勻速擠入2%氯化鈣溶液中，玻璃棒迅速攪拌均勻。用消毒海水沖洗2次，以除去殘余的氯化鈣溶液，不添加培養(yǎng)液，置于冰箱中4℃冷藏。

1.7 脂肪酸的成分分析

利用GC/MS面積歸一化法（JY/T 003-1996）對(duì)藻類提取出的脂肪酸進(jìn)行成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2/空氣比值對(duì)牟氏角毛藻生長的影響

采用上述試驗(yàn)方法培養(yǎng)牟氏角毛藻，根據(jù)每天的細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)梯度下藻的初始密度、終密度、相對(duì)生長率。該藻在本試驗(yàn)方法培養(yǎng)過程中，始終處于指數(shù)生長期，經(jīng)觀察，指數(shù)生長期可維持15～20 d。

圖1顯示不同的CO2/空氣條件下牟氏角毛藻培養(yǎng)24 h前后細(xì)胞密度的變化情況。從圖可知，牟氏角毛藻的最高終密度為15.35×106cell/mL，最低為10.67×106cell/mL；當(dāng)CO2/空氣=1/15時(shí)藻的密度變化比較明顯，說明CO2/空氣比值為1/15的條件適合牟氏角毛藻的生長。

圖2顯示在不同的CO2/空氣條件下，牟氏角毛藻相對(duì)生長率的大小。圖中顯示CO2/空氣=1/15時(shí)，該藻的相對(duì)生長率平均值最高，達(dá)1.76 d-1；其中CO2/空氣=1/25時(shí)，相對(duì)生長率平均值相對(duì)于其他梯度較低，而對(duì)照組則最低。方差分析顯示，CO2/空氣比值對(duì)牟氏角毛藻相對(duì)生長率影響極顯著（F=15.441，p<0.01），其中對(duì)照組與5個(gè)CO2/空氣梯度

圖1 CO2/空氣比值對(duì)藻密度的影響

圖2 CO2/空氣比值對(duì)藻相對(duì)生長率的影響

（同一指標(biāo)的不同小寫字母標(biāo)注表示差異達(dá)顯著水平，下同。）之間差異極顯著（p<0.01），E與B、E與 C、C與D之間差異也是極顯著（p<0.01），A與E、B與D之間差異顯著（0.010.05）。

2.2 CO2/空氣比值對(duì)牟氏角毛藻總脂含量百分比的影響

從圖3中可知，CO2/空氣=1/15時(shí)牟氏角毛藻的總脂含量百分比最高。方差分析顯示，CO2/空氣比對(duì)牟氏角毛藻總脂含量影響極顯著（F=76.524，p<0.01），其中對(duì)照組與5個(gè)梯度之間差異均極顯著（p<0.01），A與C、A與E、B與C之間差異也極顯著（p<0.01），A與D、C與D之間差異顯著（0.010.05）。這說明5個(gè)CO2/空氣梯度對(duì)牟氏角毛藻的脂肪積累都有較大提高，且CO2/空氣=1/15時(shí)最明顯。

2.3 CO2/空氣比值對(duì)牟氏角毛藻總脂日增量的影響

根據(jù)公式分別計(jì)算5個(gè)CO2/空氣比值培養(yǎng)條件下總脂日增量的大小，結(jié)果見圖4。CO2/空氣比值對(duì)牟氏角毛藻總脂日增量影響極顯著（F=38.431，p<0.01），其中對(duì)照組與5個(gè)梯度之間差異均極顯著（p<0.01），A與C、B與E、C與D、C 與 E 之間差異也極顯著（p<0.01），A與E、B與C、B與D之間差異顯著（0.010.05）。

圖3 CO2/空氣比值對(duì)總脂含量百分比的影響

圖4 CO2/空氣比值對(duì)總脂日增量的影響

牟氏角毛藻在5個(gè)CO2/空氣梯度條件下，總脂日增量的變化與相對(duì)生長率的變化趨勢相似，這說明相對(duì)生長率的大小與總脂日增量的關(guān)系密切，在藻種的總脂含量百分比相差不懸殊的情況下，相對(duì)生長率越大，總脂日增量也越大。

2.4 CO2/空氣比值對(duì)牟氏角毛藻脂肪酸組成的影響

每個(gè)梯度取一個(gè)樣本，用1.7中方法測定脂肪酸的組成，不同CO2/空氣比值下，牟氏角毛藻脂肪酸含量見表2。

表2 不同的CO2/空氣比值下牟氏角毛藻的脂肪酸組成（%）

從表2中可知，經(jīng)不同CO2/空氣比值的混合氣體培養(yǎng)，總不飽和脂肪酸的量范圍在65.28%～70.27%之間，平均為68.81%，比不通空氣的對(duì)照組提高了9.48個(gè)百分點(diǎn)。牟氏角毛藻的總不飽和脂肪酸的含量隨CO2/空氣比值的減小而增加，總飽和脂肪酸的量則呈降低趨勢。

3 結(jié)論

據(jù)袁有憲[21]、王侃等[22]報(bào)道，利用普通的搖瓶方法培養(yǎng)牟氏角毛藻，最高密度為4.8×106cell/mL；鄒寧等[23]指出，在生物反應(yīng)器中牟氏角毛藻的密度最高為10×106cell/mL。本研究表明，牟氏角毛藻終密度最高達(dá)到15.35×106cell/mL），是袁有憲、王侃等人培養(yǎng)密度的3.20倍，是鄒寧在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的1.54倍；終密度最低為10.67×106cell/mL，是前人研究的1.05～2.19倍。而在如此高的密度下，牟氏角毛藻完全可以抑制弧菌等細(xì)菌的生長[24]。從現(xiàn)有的報(bào)道來看，培養(yǎng)牟氏角毛藻時(shí)相對(duì)生長率都小于1.2 d-1；胡晗華、高坤山[8]報(bào)道了在CO2濃度倍增情況下，牟氏角毛藻的最大生長率為0.47 d-1，本研究中相對(duì)生長率在1.39～1.76 d-1范圍內(nèi)，對(duì)照組中相對(duì)生長率為1.04 d-1，可見通入不同CO2/空氣比值的混合氣體能使牟氏角毛藻生長速度加快。

蔣霞敏等[25]報(bào)道了牟氏角毛藻的總脂含量百分比為15.07%，而經(jīng)過本方法培養(yǎng)，測得該藻的總脂含量百分比有了極大的提高，在CO2/空氣=1/15時(shí)最高，達(dá)到31.25%，將牟氏角毛藻的粗脂肪含量提高了16.18個(gè)百分點(diǎn)；在CO2/空氣=1/5時(shí)最低為28.52%，仍比報(bào)道的高13.45個(gè)百分點(diǎn)。結(jié)果顯示，CO2/空氣比值在1/5～1/25之間時(shí)，牟氏角毛藻的總脂含量百分比先隨比值的減小而升高，1/15之后又有所下降，但趨于平緩，說明牟氏角毛藻在CO2/空氣=1/15時(shí)，牟氏角毛藻體內(nèi)的乙酰輔酶A羧化酶（ACC）和NADPH的生成影響顯著，有機(jī)體積累油脂的能力最強(qiáng)?？梢姡ㄈ隒O2/空氣比值為1/15的混合氣體適合牟氏角毛藻的生長與粗脂肪積累，這也為培養(yǎng)其他種類產(chǎn)能微藻提供一個(gè)借鑒方法。

研究表明，CO2/空氣=1/15時(shí)，總脂日增量最高，達(dá)樣品藻初始干重的0.75倍。根據(jù)總脂日增量與相對(duì)生長率、總脂含量百分比的函數(shù)，筆者認(rèn)為總脂日增量與相對(duì)生長率和總脂含量百分比均有聯(lián)系，與相對(duì)生長率的關(guān)系最為密切。因此，牟氏角毛藻產(chǎn)油量最高的最適CO2/空氣比值為1/15。但在實(shí)際培養(yǎng)過程中，要根據(jù)藻不同的生活習(xí)性通入不同的CO2/空氣的混合氣體，使相對(duì)生長率與總脂含量百分比達(dá)到完美的結(jié)合，從而達(dá)到高產(chǎn)油量的目的。

李荷芳[26]研究認(rèn)為，硅藻的主要脂肪酸為、和，占總脂肪酸含量的 74.6%～83.1%。硅藻綱脂肪酸組成的特點(diǎn)是的含量高于，并有高水平的另一個(gè)特點(diǎn)是含有較高含量的根據(jù)本研究結(jié)果，牟氏角毛藻的主要脂肪酸為和有高水平的含有較高含量的，這與李荷芳的研究結(jié)果相似。的含量基本上低于，與李荷芳的研究結(jié)果不一致。王海英[27]研究指出，牟氏角毛藻體內(nèi)總飽和脂肪酸占40.5%，總不飽和脂肪酸的含量為54%。本研究發(fā)現(xiàn)，牟氏角毛藻體內(nèi)總飽和脂肪酸的含量為29.73%～34.72%，低于王海英的研究結(jié)論。這些結(jié)果的產(chǎn)生與本研究的培養(yǎng)方法以及提取方法有一定的關(guān)系，還需做進(jìn)一步研究。

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