戰(zhàn)雪梅 董紅巖 孫崇偉 劉麗麗 王丹 韋志永

作者單位：276000 臨沂，山東省臨沂市人民醫(yī)院病理科 （通訊作者：董紅巖，E-mail: dhy783202003@yahoo.com.cn）

肺癌分為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC），是影響人類生存的重大疾病之一，全世界每年死于肺癌的人數(shù)占惡性腫瘤死亡總數(shù)的17.8%[1]。SHP2是含有SH2結構域的蛋白酪氨酸磷酸酶，在細胞生長、生存、侵襲、遷移等生物過程中具有重要的作用，其基因突變可導致多種惡性腫瘤的發(fā)生[2]，國內外有關SHP2在肺癌組織中表達情況的報道較少。吸煙是引起肺癌的主要危險因素，每年由于吸煙導致肺癌及其它腫瘤的死亡人數(shù)達100萬。研究[3]表明，吸煙可導致多種原癌基因突變，繼而引起細胞持續(xù)性增殖和癌變，有關SHP2在吸煙肺癌患者癌組織中的表達情況目前尚未見報道。本研究采用免疫組化和熒光原位雜交技術探討SHP2在吸煙肺癌患者腫瘤組織中的蛋白表達及mRNA擴增情況，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集山東省臨沂市人民醫(yī)院2008年8月-2009年8月手術切除肺癌病例53例，平均年齡58.1歲（30歲-77歲），男性32例，女性21例；NSCLC 48例（鱗癌17例，腺癌19例，細支氣管肺泡癌8例，其它類型4例），SCLC 5例，選擇15例癌組織旁正常支氣管上皮作為空白對照。其中，非吸煙患者為27例，吸煙指數(shù)≥400者為21例（均為NSCLC，5例SCLC中有4例吸煙史不詳）。

1.2 石蠟包埋組織免疫組化檢測 SHP2單克隆抗體購自美國Epitomics公司，采用Invision法，分為實驗組、空白對照組（加PBS代替抗體）和陽性對照組（乳腺癌組織）。SHP2蛋白定位于細胞質和細胞核，陽性產(chǎn)物為棕黃色顆粒。陽性細胞＜6%為0分，6%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分；陽性強度：黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩者積分相乘，0分為陰性（-），1分-4分為弱陽性（+），5分-8分為中度陽性（++），9分-12分為強陽性（+++）[4]。

1.3 石蠟包埋組織熒光原位雜交（FISH）檢測 人SHP2原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，探針針對石蠟包埋組織內的SHP2 mRNA，探針序列為5'-AGTATTACATGGAACATCACGGGCAATTAAAAGA G-3'、5'-ACAAGGGAATACGGAGAGAACGGTCTGGCA ATACC-3'及5'-ATGAGAGAAGACAGTGCTAGAGTCTATG AAAACGT-3'，按照說明書進行操作。探針與胞質內靶基因SHP2 mRNA結合，經(jīng)FITC標記，陽性者在熒光顯微鏡下胞質呈亮綠色。實驗分為實驗組、空白對照組（加預雜交液代替探針）和陽性對照組（乳腺癌組織）。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS軟件進行等級計數(shù)資料的秩和檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化檢測結果 SHP2在正常的支氣管上皮內呈弱陽性，而在多例肺癌組織中呈廣泛強陽性（圖1）。

2.2 FISH檢測結果 選擇SHP2強陽性表達的病例進行FISH檢測。與對照組相比，癌細胞胞質呈亮綠色，提示SHP2的mRNA有明顯的擴增（圖2），也進一步證實了免疫組化的結果。

2.3 SHP2的表達與肺癌組織學類型的關系 在15例正常支氣管上皮中，SHP2大部分呈弱陽性（80%）；在肺癌組織中，SHP2約1/3為弱陽性（32.1%），約1/2為中度陽性或強陽性（分別為47.2%和7.5%），肺癌組織中SHP2的陽性率顯著高于正常支氣管上皮（P＜0.05）（表1）。在48例NSCLC中，SHP2的弱陽性率為35.4%、中度陽性率為43.8%，強陽性率為6.2%；在5例SCLC中，SHP2的中度陽性率為80.0%，強陽性率為20.0%，SCLC中SHP2的陽性率顯著高于NSCLC（P＜0.05）（表2）。

表 1 SHP2在正常支氣管上皮和肺癌組織中的表達Tab 1 The expression of SHP2 in normal bronchial and lung cancer tissues

2.4 SHP2的表達與吸煙指數(shù)的關系 在吸煙指數(shù)≥400患者的NSCLC癌組織中，SHP2的弱陽性率為23.8%，中度陽性率為71.4%，強陽性率為4.7%（總陽性率為100%）。在非吸煙NSCLC患者癌組織中，SHP2的弱陽性率為40.7%，中度陽性率為37.4%，強陽性率為3.7%（總陽性率為81.5%），SHP2在吸煙指數(shù)≥400的癌組織中的陽性率高于非吸煙患者（P＜0.05）（表3）。

圖 1 SHP2在肺癌組織中的表達（Invision法，×100）。A：SHP2在正常支氣管粘膜中呈弱陽性；B、C和D：SHP2在肺鱗癌（B）、腺癌（C）和小細胞肺癌（D）中呈廣泛強陽性。Fig 1 SHP2 expression in lung cancer tissues (Invision , ×100). A: weak positive in normal bronchial epithelium; B,C and D: strong positive in squamous cell carcinoma (B),adenocarcinoma (C) and small cell lung cancer (D).

圖 2 肺癌組織中SHP2 mRNA擴增（熒光原位雜交法，×400）。A：空白對照組：胞質呈淡綠色，為自發(fā)熒光；B、C和D：在鱗癌（B）、腺癌（C）及小細胞肺癌（D）中，胞質呈較亮的綠色，為擴增的SHP2 mRNA。Fig 2 SHP2 mRNA amplification in lung cancer tissues (FISH,×400). A: control group: dark green in the cytoplasm,which is autofluorescence; B, C and D: in squamous cell carcinoma (B), adenocarcinoma (C) and small cell lung cancer (D), bright green in the cytoplasm was seen, which is the amplified SHP2 mRNA.

3 討論

吸煙是肺癌最重要的危險因素之一，到2030年將有800多萬人死于吸煙。煙草中所含的多環(huán)芳烴及亞硝胺類等致癌物可導致Ras、p53、Rb等基因點突變及C-met基因構成型激活等分子異常，進而導致肺癌的發(fā)生[5]。Ras-Raf-MAPK通路是吸煙導致肺癌的重要通路，Ras基因突變啟動Ras-Raf-MAPK通路是吸煙導致肺癌的重要機制[6]，KRAS基因突變在大量吸煙者的癌組織中常見[7]。在本研究中，吸煙指數(shù)≥400的NSCLC癌組織中SHP2的陽性率高于非吸煙者，提示吸煙可能與SHP2表達增高相關。在吸煙NSCLC患者癌組織中，RAS基因突變與SHP2分子異常的關系如何？目前國內外未見報道，本課題組擬進一步開展相關研究。

表 2 SHP2在NSCLC和SCLC中的表達Tab 2 The expression of SHP2 in NSCLC and SCLC

表 3 在NSCLC患者中SHP2表達與吸煙指數(shù)的關系Tab 3 The relationship between SHP2 and smoking index among NSCLC patients

SHP2是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成員之一，它在發(fā)育、生長、增殖、凋亡和分化等生物學過程中起重要作用[8]。SHP2在EGF、PDGF、FGF等觸發(fā)的信號通路中起正性調節(jié)作用，在α-干擾素、γ-干擾素觸發(fā)的Jak-Stat信號通路中起負性調節(jié)作用。SHP2可促進RAS的激活，其確切機制不明[9]。

研究[10]表明，SHP2是青少年粒-單核細胞性白血病、髓細胞性白血病、慢性粒-單核細胞性白血病的病因，在乳腺癌中表達率較高，與幽門螺旋桿菌相關胃癌的發(fā)生相關，有關SHP2在肺癌組織中的表達情況國內外文獻較少。本研究表明，SHP2在肺癌組織中陽性率較高，最近國內的一個課題組也得出類似的結果[11]。這一結果提示，SHP2在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮一定的作用，其具體機制有待深入研究。已知EGFR基因突變和KRAS基因突變是肺癌發(fā)病機制中最重要的兩個突變[7]，可以通過檢測肺癌組織中EGFR基因擴增或突變、RAS基因突變與SHP2的PTPN11基因擴增或突變之間的關系，從而確定在肺癌發(fā)病過程中SHP2是否及如何發(fā)揮重要作用。

目前，以蛋白酪氨酸激酶為靶點的藥物研發(fā)已成為NSCLC治療的研究熱點之一，而SHP2作為蛋白酪氨酸磷酸酶的家族成員之一，在多種細胞信號通路中起著重要的調節(jié)作用[12]，其異常表達可導致多種疾病的發(fā)生，所以完全具備作為藥物作用靶點開發(fā)的條件，本課題為這一方面的研究提供了新的依據(jù)。SCLC對放療和化療頗為敏感但很難治愈，而以SHP2為靶點研發(fā)新藥為SCLC的藥物治療提供了新的思路。

磷酸化酪氨酸在NSCLC癌組織中的表達水平較高[13]，蛋白酪氨酸磷酸酶TEP1在肺癌組織中的表達遠低于良性病變的肺組織[14]，而本研究中蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2在肺癌組織中的表達顯著增高。作者認為，肺癌組織中的磷酸化酪氨酸水平反應了整個酪氨酸磷酸酶的功能狀態(tài)，可以通過進一步檢測SHP2的磷酸酶活性與磷酸化酪氨酸水平之間的相關性以了解SHP2對肺癌組織中酪氨酸磷酸化水平的影響。