張軍 鄭鍇 郭燕 張鵬 戰(zhàn)忠利

作者單位：300052 天津，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心胸外科（張軍，鄭鍇，張鵬）；300060 天津，天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科（郭燕，戰(zhàn)忠利）（通訊作者：鄭鍇，E-mail: cns2008@163.com）

肺癌現(xiàn)已成為臨床常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)其細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生物學(xué)和臨床特征的不同可分為小細(xì)胞癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）。SCLC具有神經(jīng)內(nèi)分泌（neuroendocrine, NE）分化的特征，屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。但近年來研究發(fā)現(xiàn)NSCLC同樣也具有NE分化的特性[1]，并且WHO在1999年重新修訂的肺與胸膜腫瘤組織病理學(xué)分類中增加了NSCLC伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化的概念[2]，由于NSCLC占肺癌中絕大多數(shù)，故對其生物學(xué)特性及預(yù)后等的研究具有重要臨床價(jià)值。本研究選取神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSE）、突觸素（synaptophysin, Syn）及嗜鉻素A（chromogranin A, CgA）三種標(biāo)記物聯(lián)合應(yīng)用，判斷是否具有NE分化，并進(jìn)一步探討NE分化及這三種標(biāo)記物的表達(dá)同NSCLC的生物特性及預(yù)后的相關(guān)性，從而為臨床治療及預(yù)后的評(píng)估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 本研究的資料來源于天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2005年1月-2007年12月、經(jīng)外科手術(shù)治療并病理證實(shí)為NSCLC，隨訪滿3年的206例患者，所有患者術(shù)前均未經(jīng)過放化療。其中，男性112例，女性94例。年齡38歲-75歲，中位年齡61歲，臨床分期為I期-IIIa期，依據(jù)2004年版WHO最新肺癌病理學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)分類，其中鱗癌98例，腺癌76例，腺鱗癌20例，其它類型12例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 試劑和方法

1.2.1 主要試劑 即用型鼠抗人NSE、CgA和Syn單克隆抗體的EnVision二步法試劑盒均由丹麥DAKO公司提供，購于基因科技（上海）有限公司。

1.2.2 免疫組化EnVision二步法 石蠟連續(xù)切片5張，厚4 μm。1張用于HE染色，余供免疫組化用。石蠟切片預(yù)處理。二甲苯，乙醇梯度水化，染色前用1 mmol/L Tris-EDTA（pH9.0）進(jìn)行高壓加熱修復(fù)抗原。切片0.3%H2O2避光處理20 min；然后PBS洗3次，每次5 min，加入一抗，將切片放入4oC冰箱過夜。轉(zhuǎn)天取出濕盒，復(fù)溫30 min后，PBS洗3次，每次5 min，加入二抗。室溫放置30 min后，PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色5 min-10 min，蒸餾水沖洗。蘇木素復(fù)染，脫水，封片。用已知陽性的類癌切片為陽性對照，并以切片中出現(xiàn)神經(jīng)陽性為內(nèi)對照，已知陽性切片以PBS代替一抗進(jìn)行空白對照。

1.2.3 陽性結(jié)果判斷 背景清晰，胞漿內(nèi)可見明確的棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細(xì)胞，每例隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野（×400），陽性染色的癌細(xì)胞≤5%視為陰性（-）＞5%視為陽性（+），其中陽性癌細(xì)胞5%-10%為（+），11%-20%（++），21%-50%（+++）。有下述情況之一者確定伴NE分化：有一種NE標(biāo)記物—表達(dá)為（+++），或至少有兩種標(biāo)記物表達(dá)為（+-++）。

1.3 隨訪 所有患者以病例跟蹤，電話隨訪為主，信件隨訪輔助。隨訪時(shí)間從手術(shù)之日開始至死亡或是最后1次隨訪，以月為單位計(jì)算，隨訪滿3年截止。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。應(yīng)用R×C列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)，比較三種NE標(biāo)記物及NE與臨床生物學(xué)特征的關(guān)系。單因素生存分析采用Kaplan-Meier曲線描述生存率，并行Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NE標(biāo)記物在NSCLC中的表達(dá) 三種神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記物的陽性部位均為胞漿著色，呈棕色顆粒。NSE、Syn多呈彌漫性胞漿著色（圖1），CgA呈灶性分布或?yàn)閺浡灾▓D2）。依據(jù)至少2種NE標(biāo)記物陽性的病例診為伴有NE分化的NSCLC的判斷標(biāo)準(zhǔn)，206例NSCLC中伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化者82例（占39.8%），不伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化者124例；CgA陽性例數(shù)為53例（25.7%），NSE陽性例數(shù)為104例（50.5%），Syn陽性例數(shù)為91例（44.2%）。

2.2 組織分型與NE分化及其標(biāo)記物的表達(dá) 不同組織分型的肺癌中NE分化及其標(biāo)記物表達(dá)的情況見表1，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，NE分化與臨床病理類型無相關(guān)性。

2.3 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與NE分化及其標(biāo)志物的表達(dá) 三組標(biāo)記物中，Syn陽性表達(dá)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P=0.028）；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與NE分化間無相關(guān)性（表2）。2.4 腫瘤分化程度與NE標(biāo)記物的表達(dá) NE分化的陽性率和其標(biāo)記物在低分化的NSCLC中表達(dá)較高，中分化組明顯升高；Syn的陽性率表達(dá)在三組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

2.5 生存分析 所有NSCLC患者隨訪結(jié)果顯示，伴有NE分化82例，其中死亡35例，3年生存率為57.3%；不伴有NE分化124例，其中死亡34例，3年生存率為68.5%。經(jīng)Logrank檢驗(yàn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

CgA和NSE的陽性表達(dá)與患者預(yù)后亦無相關(guān)性（P＞0.05）；但Syn的陽性率與患者的生存期之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.164, P=0.041）（圖3）。

圖 1 Syn在肺腺癌中的表達(dá)（EnVision, ×400）。Syn：突觸素。Fig 1 Syn positive staining in lung adenocarcinoma (EnVision, ×400).Syn: synaptophysin.

表 1 各型NSCLC的Syn、CgA和NSE的陽性率Tab 1 The positive rates of CgA、NSE and Syn

表 2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與NE分化相關(guān)性Tab 2 The relationship between Lymph node metastasis and NE differentiation

表 3 NE標(biāo)記物陽性率與NSCLC分化程度的關(guān)系Tab 3 The relationship between positive rate of NE and histological differentiation

圖 2 CgA在鱗癌中的表達(dá)（EnVision，×200）。CgA：嗜鉻素A。Fig 2 CgA positive staining in squamous cell carcinoma (EnVision, ×200).CgA: chromogranin A.

圖 3 Syn分化與患者的生存曲線Fig 3 Surivival curves of patients with Syn of non-small cell lung cancer

3 討論

大量研究已經(jīng)證實(shí)，人體肺臟是一個(gè)內(nèi)分泌器官，SCLC屬神經(jīng)內(nèi)分泌癌。但近年來發(fā)現(xiàn)NSCLC中也存在著不同程度的NE標(biāo)志[3-5]。1999年重新修訂的“肺與胸膜腫瘤組織病理學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)”中新增加了NSCLC伴NE分化的概念。并指出其特異性標(biāo)記物為CgA與Syn。2003年神經(jīng)內(nèi)分泌癌/分化的判斷指出：腫瘤組織中，一種NE標(biāo)記物明確陽性，且陽性細(xì)胞數(shù)＞50%時(shí)可診斷為神經(jīng)內(nèi)分泌癌，否則為伴NE分化。

目前，研究NE的方法有多種[6]，如：生物素檢測系統(tǒng)、電鏡/免疫組織化學(xué)法等，其中Slodkowsk等[7]研究認(rèn)為免疫組化為檢測NE分化的標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究采用EnVision檢測系統(tǒng)，原理是EnVision復(fù)合物與已結(jié)合抗原的標(biāo)的一抗結(jié)合，形成含酶（HRP或AP）的抗原抗體多聚復(fù)合物。該系統(tǒng)較傳統(tǒng)的三步法敏感性增強(qiáng)，由于不再是生物素標(biāo)記二抗與鏈親和素標(biāo)記的三抗結(jié)合，所以整個(gè)系統(tǒng)不受內(nèi)源性生物素的干擾，減低了背景。

盡管有眾多NE分化標(biāo)志抗原和免疫組化技術(shù)的不斷發(fā)展，但由于抗原含量甚微或是其前體分子較大，使針對這些抗原的抗體敏感性受限；同時(shí)抗原存在交叉反應(yīng)，使抗體的特異性不夠理想[8]。目前認(rèn)為NSE、CgA及Syn的組合是一組特異性和敏感性較好的NE分化的共同標(biāo)志，可作為標(biāo)準(zhǔn)的檢測指標(biāo)。本研究結(jié)果為NSCLC伴NE分化陽性率為39.8%，NSE陽性率50.5%，Syn陽性率44.2%，CgA陽性率25.7%，這與相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果相近。同時(shí)，Syn陽性率隨腫瘤細(xì)胞分化程度降低而升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Syn陽性表達(dá)率與NE陽性表達(dá)率相近，所以Syn可作為診斷NSCLC伴NE分化的主要標(biāo)志物。

同時(shí)CgA、NSE及Syn三種標(biāo)記物的敏感性及特異性有所不同。NSE陽性表達(dá)例數(shù)多于后兩者，但其在不同組別間的陽性差異卻較后兩者小，說明其雖然敏感性高，但特異性較差。相比之下，CgA和Syn的特異性較高，但CgA的敏感性較Syn差，CgA陽性表達(dá)的53例中有50例Syn亦為陽性，提示凡CgA能夠識(shí)別的NE分化者，Syn幾乎也能夠判定；故而我們認(rèn)為聯(lián)合應(yīng)用NSE及Syn是判斷是否具有NE分化的較為可靠的指標(biāo)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NE分化與術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度相關(guān)。NE分化與術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無相關(guān)性，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的Syn陽性率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。NSCLC的分化程度越低，伴NE分化的陽性率越高。故可認(rèn)為腫瘤的分化程度對NE的診斷和Syn的陽性率均有著非常重要的意義。所以NSCLC伴NE分化與腫瘤的分化程度相關(guān)。但我們認(rèn)為NE分化同生存期并無相關(guān)性，而Syn陽性表達(dá)作單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，Syn標(biāo)記物的陽性表達(dá)與生存期相關(guān)（P=0.041），隨著患者生存時(shí)間的延長，這種差異越明顯。這與Howe等[9]的研究結(jié)果相符。這一結(jié)果提示Syn對NSCLC患者的臨床和預(yù)后的評(píng)估有起著關(guān)鍵的作用。Gonzalez等[10]研究I期鱗癌及腺癌患者中，結(jié)果Syn陽性表達(dá)患者的腫瘤更具侵襲性，預(yù)后更差。本研究中，NSCLC低分化組的Syn陽性率表達(dá)均高（P＜0.05）。說明隨著Syn陽性率的升高，腫瘤的侵襲性增強(qiáng)。

綜上所述，NSCLC伴NE分化與其腫瘤細(xì)胞的分化程度相關(guān)，腫瘤細(xì)胞分化越低，NE陽性表達(dá)率越高。腫瘤低分化患者Syn陽性表達(dá)率與NE陽性表達(dá)率接近（兩種標(biāo)記物同時(shí)表達(dá)為陽性）。故Syn可作為NSCLC伴NE的診斷標(biāo)志物。同時(shí)，Syn標(biāo)記物的陽性表達(dá)與生存期相關(guān)，可為臨床對患者的診治及預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。在NSCLC中NE分化同腫瘤的多種生物學(xué)行為相關(guān)，可以作為判定腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的獨(dú)立指標(biāo)。