劉冰冰 張四洋 惠林萍 邱雪杉 崔澤實

作者單位：110001 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)實驗技術(shù)中心三部（劉冰冰，張四洋，崔澤實）；110032 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院中心實驗室（惠林萍）；110001 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科（邱雪杉）；（通訊作者：崔澤實，E-mail: labczs@mail.cmu.edu.cn；邱雪杉，E-mail:qiuxues@hotmail.com）

鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄抑制因子（positive regulatory domain zinc finger protein, PRDM）是一個新確認(rèn)的蛋白序列，是一個與人類腫瘤形成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族[1]。盡管PRDM在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用還不十分清楚，但近年來有研究[2]表明PRDM家族的成員在細(xì)胞分化和惡性變中發(fā)揮重要作用。PRDM14是PRDM家族成員之一，具有1個PR-domain和6個鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白。PRDM14位于染色體8q13.3上。最近有研究[3]通過基因芯片鑒定PRDM14在特定的未分化的人類胚胎干細(xì)胞中表達(dá)。Noriko等[4]研究發(fā)現(xiàn)在正常乳腺組織里幾乎沒有PRDM14的表達(dá)，而在乳腺癌中PRDM14常常過表達(dá)，異常表達(dá)的PRDM14促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長并降低了腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。而且據(jù)Dettman等[5]的研究，PRDM14在Evi32原病毒整合的腫瘤中過表達(dá)。但PRDM14在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況尚不明了。本研究選擇非小細(xì)胞肺癌患者為研究對象，檢測PRDM14在不同組織學(xué)類型非小細(xì)胞肺癌和不同非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 材料 70例非小細(xì)胞肺癌組織石蠟標(biāo)本及7例癌旁肺組織標(biāo)本用于免疫組化檢測，標(biāo)本來自2000年11月-2006年4月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行非小細(xì)胞肺癌切除手術(shù)的患者?；颊咝g(shù)前均未接受過放化療?；颊咂骄挲g59歲（20歲-81歲），其中男性40例，女性30例。非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本根據(jù)世界衛(wèi)生組織2004年的分類標(biāo)準(zhǔn)分為腺癌44例，鱗癌26例；其中高分化13例、中分化40例、低分化17例。40例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）1997年修訂的非小細(xì)胞肺癌P-TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：I期23例，II期22例，III期25例。42例非小細(xì)胞肺癌及癌旁肺組織標(biāo)本用于Western blot檢測，標(biāo)本來自于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行非小細(xì)胞肺癌切除手術(shù)的患者?；颊咝g(shù)前均未接受過放化療。其中男性26例，女性16例。非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本根據(jù)世界衛(wèi)生組織2004年的分類標(biāo)準(zhǔn)分為腺癌24例，鱗癌18例；其中高、中分化31例、低分化11例，18例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

PRDM14兔抗人多克隆抗體PRDM14（Ab28638）購自美國Abcam生物技術(shù)公司，SP超敏免疫組織化學(xué)試劑盒（KIT-9710）和DAB顯色試劑盒（DAB-0031）購自福州邁新生物技術(shù)公司，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測PRDM14的表達(dá) 所有切除標(biāo)本均用10%甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm厚切片（RM2155，LEICA德國），經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后，采用鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化物酶法（SP法）檢測PRDM14蛋白表達(dá)情況。首先高溫高壓修復(fù)抗原，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，然后使用PRDM14一抗（1:250）4oC濕盒內(nèi)反應(yīng)過夜，次日依次滴加生物素標(biāo)記的二抗和鏈菌素抗生物素蛋白-過氧化物酶，DAB顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核；以PBS代替一抗作為陰性對照。

判定標(biāo)準(zhǔn)：每張切片在顯微鏡（×400）下隨機(jī)選取10個視野觀測，每個視野計數(shù)100個腫瘤細(xì)胞，計數(shù)其中的陽性細(xì)胞數(shù)，然后取平均值。染色強(qiáng)度分級為：陰性為0，淡黃色為1，棕黃色為2，深棕色為3。以陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)分級：＜5%為0，5%-25%為1，26%-50%為2，＞50%為3。利用染色強(qiáng)度與陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)乘積來評定結(jié)果，0為陰性，1為弱陽性，2-4為陽性，6-9為強(qiáng)陽性。

1.2.2 Western blot檢測PRDM14的表達(dá) 以β-actin為內(nèi)參，42例新鮮非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁對照組織標(biāo)本均快速剪取適量組織，勻漿、破碎、12 000 g離心20 min、取上清液、紫外分光光度計檢測蛋白提取物的吸光度，計算蛋白濃度。沸水變性，用10%分離膠、5%濃縮膠的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉液封閉，TBST沖洗后，分別與一抗、二抗雜交，用ECL成像系統(tǒng)（MF-Chemi BIS 3.2, DNR, Israel）采集圖像，測定條帶光密度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析，對PRDM14的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系采用兩組資料非參數(shù)秩和檢驗（性別、年齡、組織學(xué)類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況）和多組資料非參數(shù)秩和檢驗（TNM分期和分化）。Western blot光密度值分析采用非小細(xì)胞肺癌組織和癌旁組織配對t檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測PRDM14的表達(dá) 免疫組化方法檢測PRDM14在70例肺鱗癌、腺癌和7例癌旁肺組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達(dá)陽性信號定位于胞漿。在70例肺鱗癌、腺癌組織中，有8例為PRDM14陰性表達(dá)（11.43%），9例為PRDM14弱陽性表達(dá)（12.86%），36例PRDM14陽性表達(dá)（51.43%），有17例PRDM14強(qiáng)陽性表達(dá)（24.29%）（圖1）。PRDM14在7例癌旁肺組織中弱表達(dá)。PRDM14的表達(dá)情況與非小細(xì)胞肺癌的分化程度和組織學(xué)類型有關(guān)。PRDM14在高、中分化腺癌、鱗癌中高表達(dá)，在低分化腺癌、鱗癌中低表達(dá)（P=0.046）；PRDM14在腺癌中的表達(dá)高于鱗癌（P=0.047）；PRDM14的表達(dá)水平與患者的性別（P=0.820）、年齡（P=0.126）、TNM分期（P=0.052）和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.240）無統(tǒng)計學(xué)差異（表1）。

表 1 免疫組化檢測肺癌中PRDM14的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab 1 The expressions of PRDM14 and clinicopathologic characteristics in lung squamous cell carcinoma and adenocarcinoma

2.2 Western blot檢測PRDM14的表達(dá) 42例癌旁組織中33例出現(xiàn)特異性目的條帶（64 kDa），42例非小細(xì)胞肺癌組織中36例出現(xiàn)特異性染色條帶（64 kDa）（圖2）。對癌旁與非小細(xì)胞肺癌組織的光密度值分別與β-actin光密度值的比值進(jìn)行配對t檢驗，結(jié)果顯示癌旁組織與肺鱗癌、腺癌中PRDM14的表達(dá)水平存在統(tǒng)計學(xué)差異。PRDM14在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)顯著高于癌旁肺組織（P＜0.001）。而且PRDM14的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的分化程度有關(guān)（表2），PRDM14在高中分化的非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)高于低分化的非小細(xì)胞肺癌組織（P=0.017）。而PRDM14的表達(dá)與組織學(xué)類型（P=0.879）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.455）。

3 討論

PRDM是一個與人類腫瘤形成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族[1]，PRDM基因編碼的蛋白對維持細(xì)胞的完整性和控制細(xì)胞的分化、生長及凋亡起著關(guān)鍵作用[6]。PRDM家族成員均具有PR-domain和不同數(shù)目的重復(fù)鋅指序列，家族成員主要功能與組氨酸去乙?；凹谆嘘P(guān)，在人類癌癥中主要起到抑制腫瘤細(xì)胞的作用[7]。PRDM家族成員與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，PRDM1和PRDM2均編碼一個C-MYC轉(zhuǎn)錄抑制物，均可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞成熟，導(dǎo)致生長停止并顯示凋亡前活性，其與大細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生有關(guān)[8]。PRDM3在骨髓組織化生中通常是變異的，與多發(fā)性骨髓瘤有關(guān)[9]，而且與造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)[10]。PRDM4位于腫瘤抑制物區(qū)12q，而且在DNA合成中過表達(dá)[2]。PRDM5在乳腺癌、卵巢癌和肝癌中保持沉默[1]。PRDM13也與腫瘤形成有關(guān)[11]。PRDM16已經(jīng)被認(rèn)為與急性髓細(xì)胞性白血病相關(guān)[12-14]。另外，PRDM9與卵巢癌相關(guān)[15]，PRDM15與胰腺癌也相關(guān)[16]。據(jù)報道[4]PRDM14在乳腺癌組織中過表達(dá)，但目前PRDM14在其它癌癥中的表達(dá)情況還不清楚。

圖 1 PRDM14在肺腺癌和鱗癌中的表達(dá)（SP，×400）。A：PRDM14在癌旁肺組織的表達(dá)較弱，細(xì)胞漿表達(dá)；B：PRDM14在高分化腺癌中高表達(dá)，細(xì)胞漿表達(dá)；C：PRDM14在中分化腺癌中高表達(dá)，細(xì)胞漿表達(dá)；D：PRDM14在低分化腺癌中低表達(dá)，細(xì)胞漿表達(dá)；E：PRDM14在高分化鱗癌中高表達(dá)，細(xì)胞漿表達(dá)；F：PRDM14在中分化鱗癌中高表達(dá)，細(xì)胞漿表達(dá)；G：PRDM14在低分化鱗癌中低表達(dá)，細(xì)胞漿表達(dá)。Fig 1 The expressions of PRDM14 in lung adencarcinoma and squamous cell carcinoma (SP, ×400). A: The weak positive cytoplasmic expression of PRDM14 in corresponding normal lung; B: The positive cytoplasmic expression of PRDM14 in lung adenocarcinoma; C: The positive cytoplasmic expression of PRDM14 in lung adenocarcinoma; D: The low expression of PRDM14 in lung adenocarcinoma; E: The positive cytoplasmic expression of PRDM14 in lung squamous cell carcinoma; F: The positive cytoplasmic expression of PRDM14 in lung squamous cell carcinoma; G: The low expression of PRDM14 in lung squamous cell carcinoma.

圖 2 PRDM14蛋白在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)。A：PRDM14蛋白在肺癌組織和癌旁組織表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果。N：癌旁組織；HS：高分化鱗癌；LS：低分化鱗癌；HA：高分化腺癌；LA：低分化腺癌。B：癌旁組織中PRDM14的表達(dá)量明顯低于非小細(xì)胞肺癌組織，**P＜0.001。Fig 2 The expressions of PRDM14 in the non-small cell lung cancer tissue and paracancerous tissue. A: The Western blot results showed the expressions of PRDM14 in the non-small cell lung cancer tissue and paracancerous tissue; N: Paracancerous tissue; HS: High differentiated squamous cell carcinoma; LS: Low differentiated squamous cell carcinoma; HA: High differentiated adencarcinoma; LA: Low differentiated adencarcinoma. B: The expression of PRDM14 in paracancerous tissue was lower than that of non-small cell lung cancer tissue, **P＜0.001.

表 2 PRDM14表達(dá)的Western blot檢測結(jié)果與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab 2 The relationship of expressions of PRDM14 in lung sqnamous cell carcinoma and adenocarcinoma tested by Western blot and clinicopathologic characteristics

本研究中檢測了PRDM14在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平，免疫組化結(jié)果顯示，在癌旁肺組織中PRDM14弱表達(dá)，在肺鱗癌和腺癌中PRDM14較高表達(dá)。Noriko等[4]研究也發(fā)現(xiàn)在正常乳腺組織里幾乎沒有PRDM14的表達(dá)，而在乳腺癌中PRDM14常常過表達(dá)；有研究[17]表明PRDM14在Evi32原病毒整合的腫瘤中過表達(dá)；劉艷艷等[18]研究PRDM14的同族因子PRDM1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平的免疫組化結(jié)果中PRDM1也是在鱗狀細(xì)胞癌中優(yōu)勢表達(dá)；與本研究中抑癌家族PRDM成員PRDM14在腫瘤中的異常表達(dá)情況是一致的。可能是PR區(qū)域家族成員在癌癥發(fā)生過程中的一種異常的“陰-陽”調(diào)節(jié)方式的作用，或與組氨酸去乙酰化及甲基化有關(guān)[19]。

本研究統(tǒng)計分析結(jié)果表明PRDM14的表達(dá)情況與非小細(xì)胞肺癌的分化程度和組織學(xué)類型有關(guān)。隨著分化程度的升高PRDM14的表達(dá)水平也升高，推測PRDM14在肺癌發(fā)生的早期起作用，促進(jìn)細(xì)胞增殖，在肺癌發(fā)展到嚴(yán)重分化不良時，可能由于PR域的CpG島甲基化使mRNA表達(dá)受到抑制，引起了其蛋白表達(dá)的下調(diào)。另用Western blot檢測了PRDM14蛋白在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PRDM14的蛋白表達(dá)在肺鱗癌和腺癌中均高于癌旁肺組織，而且與非小細(xì)胞癌的分化程度有關(guān)，與非小細(xì)胞肺癌組織免疫組化檢測的結(jié)果一致，但與組織學(xué)類型無關(guān)，這可能是病例樣本相對于免疫組化樣本例數(shù)較少，有待于擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。

Noriko等[4]研究還發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的PRDM14促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長并降低了腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，PRDM14的第二內(nèi)含子增加了DNA甲基化水平，在乳腺癌細(xì)胞中增加的甲基化區(qū)域與PRDM14高表達(dá)有關(guān)，而且其原因與基因擴(kuò)增有關(guān)。劉艷艷等[18]對PRDM14的同家族基因PRDM1在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，PRDM1在肺鱗癌中高度表達(dá)，肺鱗癌中PRDM1在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上均存在異常。本研究中PRDM14在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)具體機(jī)制是否與甲基化、基因擴(kuò)增有關(guān)以及在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上是否存在異常有待進(jìn)一步研究。