趙向飛 劉曉晴 郭萬峰 李曉兵

碳酸酐酶IX（carbonic anhydrase IX, CAIX）是新發(fā)現(xiàn)的碳酸酐酶家族的異構(gòu)體之一，與腫瘤的乏氧代謝密切相關(guān)。細胞核增殖抗原（proliferating cell nuclear antigen,Ki67） 的表達出現(xiàn)于除G0期、G1期早期以外的細胞周期中，被認為是能較可靠、全面地反映細胞群體增殖活性的客觀指標；血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）與腫瘤血管生成呈正相關(guān)。目前國內(nèi)外關(guān)于CAIX在非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中的表達及其與Ki67、VEGF表達的相關(guān)性研究較少，尤其是CAIX表達與肺癌治療的相關(guān)性尚未見報道。本實驗使用免疫組化的方法檢測CAIX蛋白在NSCLC組織中的表達情況，分析其與放療及增殖指標Ki67、血管增生指標VEGF的相關(guān)性，研究CAIX與NSCLC發(fā)病及治療的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院肺癌內(nèi)科1999年1月-2005年12月住院治療并經(jīng)病理證實的NSCLC 76例，男性53例，女性23例。年齡30歲-75歲，中位年齡59歲。其中腺癌43例，鱗癌33例；低分化43例，中分化16例，高分化17例；分期：I期/II期13例，III期/IV期63例；接受放療患者34例?；颊呔鶠槌踔位颊?。另取10例炎性假瘤標本作為陰性對照。

1.2 治療方法 放療方案為胸部病灶放療劑量為60 Gy-72 Gy，頸、鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶為60 Gy-70 Gy，腦轉(zhuǎn)移灶為38 Gy-52 Gy，放療方式為常規(guī)放療與適形或調(diào)強放療，分割方式有常規(guī)分割、超分割與低分割。部分放療患者聯(lián)合含鉑類方案化療。

1.3 主要試劑 兔抗人CAIX單抗、鼠抗人VEGF單抗、兔抗人Ki67單抗及PV-8000免疫組化試劑盒均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。CAIX工作濃度為1:50，稀釋劑為PBS；VEGF、Ki67工作濃度為1:100，稀釋劑為PBS。

1.4 實驗方法 采用免疫組化SP法，標本切片為4 μm，經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后進行高壓抗原修復(fù)，滴加抗體后置于4oC冰箱過夜。用已知染色陽性的膽囊上皮切片作為陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.5 免疫組化結(jié)果判斷 所有樣本均經(jīng)過兩位病理醫(yī)師進行評估。CAIX蛋白以細胞膜呈棕黃色為陽性標記（圖1A1和圖1B2），VEGF以胞漿呈棕黃色顆粒為陽性標記（圖1A2和圖1B2），Ki67以胞核呈棕黃色顆粒為陽性標記（圖1A3和圖1B3），結(jié)果判斷采用半定量積分法，在高倍鏡下隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，共計1 000個，計算每張切片陽性細胞百分率，根據(jù)切片上陽性細胞所占百分比計分。陽性細胞≤5%為0分，6%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分；顯色度按細胞著色深淺計分：0分細胞無著色，1分淺黃色，2分棕黃色，3分棕褐色。兩者積分相乘，0分-4分為陰性，5分-12分為陽性。

1.6 療效評價標準 按照世界衛(wèi)生組織（WHO）抗腫瘤治療的客觀療效標準進行評價。完全緩解（complete response, CR）：完全消失，無新病灶，無疾病相關(guān)癥狀，至少持續(xù)4周；部分緩解（partial response, PR）：與基線相比，病灶兩個最大垂直橫徑乘積總和減少＞50%，且持續(xù)4周；穩(wěn)定（stable disease, SD）：與基線相比，未達CR、PR，無疾病進展，無新病灶形成；進展（progressive disease, PD）：與基線相比，病灶兩個最大垂直橫徑乘積增大＞25%，或任何可評估的病灶出現(xiàn)惡化或發(fā)現(xiàn)新病灶。以療效CR+PR為有效組，療效SD+PD為無效組。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，均數(shù)比較采用t檢驗，等級相關(guān)用Spearman分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC及炎性假瘤組織中CAIX蛋白的表達 76例NSCLC組織中，35例CAIX表達呈陽性，陽性率為46.1%，而在良性病變炎性假瘤組中無表達，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。

2.2 CAIX蛋白在NSCLC中的表達 CAIX蛋白表達在鱗癌組的陽性率為23/33（69.7%），明顯高于腺癌組12/43（27.9%），差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）；CAIX蛋白表達在不同分化程度之間差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.005）；但CAIX蛋白表達在性別、年齡、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、吸煙、體重下降各組間表達差異無統(tǒng)計學意義（表1）。

2.3 CAIX蛋白表達與放療療效的相關(guān)性 CAIX陽性組18例，客觀反應(yīng)率（objective response rate, ORR）（CR+PR）為27.8%，CAIX陰性組16例，陽性例數(shù)13例，陽性率62.5%，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義（P=0.042）（表2）。

2.4 NSCLC中VEGF和Ki67的表達與臨床病理因素的關(guān)系76例NSCLC組織中，55例VEGF表達呈陽性，陽性率為72.4%，與是否存在體重下降具有相關(guān)性（P=0.016），在性別、年齡、組織學類型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、吸煙、KPS評分方面，各組間表達差異無統(tǒng)計學意義。在76例NSCLC組織中有32例Ki67表達陽性，陽性率為42.1%，在性別、年齡、組織學類型、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、吸煙、KPS評分、體重下降方面，各組間表達差異均無統(tǒng)計學意義。

表 1 CAIX與NSCLC患者臨床病理特征相關(guān)性Fig 1 Relationship between expression of CAIX with clinicopathologic characteristics in NSCLC

2.5 NSCLC組織中CAIX蛋白表達與VEGF、Ki67表達的相關(guān)性 76例NSCLC組織中，55例患者VEGF表達陽性，其中CAIX表達陽性者為29例（52.7%），在VEGF表達陰性的21例患者中，CAIX表達陽性者為16例，二者表達呈正相關(guān)（r=0.231, P=0.043）；CAIX和Ki67共同表達陽性者為15例，在Ki67表達陰性的46例中，CAIX表達陽性者為20例，二者表達無相關(guān)性（r=0.064, P=0.583）（表3，表4）。

3 討論

CAIX最早被稱為MN蛋白，是1993年由Pastorekova在與人乳腺癌細胞聯(lián)合培養(yǎng)的人宮頸癌的HeLa細胞系中發(fā)現(xiàn)的[1]。CAIX蛋白在正常人上消化道及消化道相關(guān)器官如胰腺、膽囊、肝臟中大量表達，正常人心臟、肺、腎、前列腺、外周血、腦、胎盤及肌肉組織中不表達CAIX[2]。CAIX在NSCLC中的表達情況報道不一，現(xiàn)有的文獻[3-5]報道，CAIX蛋白在NSCLC組織中的表達陽性率為36.4%-81%，我們的研究使用免疫組化的方法檢測CAIX在NSCLC中的表達，結(jié)果顯示在NSCLC患者中CAIX表達陽性率達46.1%，10例良性病變無一例存在CAIX表達，提示CAIX有作為臨床肺部病變鑒別良惡性指標的潛力，鱗癌患者陽性率明顯高于腺癌患者，這與Giatromanolaki研究[5]的結(jié)果是一致的，在不同的分化程度的患者中，CAIX表達陽性率也有差異，表明CAIX與NSCLC的發(fā)生或發(fā)展存在相關(guān)性。CAIX的表達與腫瘤的乏氧代謝密切相關(guān)，在實體腫瘤中，多數(shù)腫瘤細胞生長迅速，血管的生長速度相對滯后，以致內(nèi)部腫瘤細胞供血不足，導(dǎo)致腫瘤細胞乏氧，古模發(fā)[6]使用乏氧組織顯像劑99mTc-HL91對照檢測了41例肺癌患者和33例非肺癌患者，發(fā)現(xiàn)對照組33例均為無明顯乏氧；肺癌組則無明顯乏氧0例，低度乏氧18例，高度乏氧23例，各組分布有明顯差異。Le[7]在早期NSCLC患者術(shù)中直接用電極測量癌組織的氧濃度，分析了其與肺癌組織CAIX蛋白表達的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者存在負相關(guān)，認為在NSCLC中CAIX表達與乏氧相關(guān)，可以作為乏氧代謝的觀測指標。在我們的研究中，CAIX表達與NSCLC的相關(guān)性間接提示了NSCLC組織中存在乏氧，鱗癌患者腫瘤組織中乏氧存在的比例可能高于腺癌患者。

圖 1 CAIX、VEGF和Ki67在肺腺癌及肺鱗癌組織中的表達。A：腺癌；B：鱗癌；1：CAIX（+）；2：VEGF（+）；3：Ki67（+）。A1：SP，×200；A2：SP，×400；A3：SP，×200；B1：SP，×200；B2：SP，×400；B3：SP，×200。Fig 1 The expression of CAIX, VEGF and Ki67 in NSCLC. A: adenocarcinoma; B: squamous cell carcinoma; 1: CAIX (+); 2: VEGF (+); 3: Ki67 (+). A1: SP, ×200; A2: SP, ×400; A3: SP, ×200; B1: SP, ×200; B2: SP, ×400; B3: SP, ×200.

表 2 CAIX表達與放療療效客觀反應(yīng)率的相關(guān)性Fig 2 Relationship between expression of CAIX with ORR of radiotherapy in NSCLC

表 3 CAIX蛋白表達與VEGF表達的相關(guān)性Fig 3 Relationship between expression of CAIX with VEGF in NSCLC

表 4 CAIX蛋白表達與Ki67表達的相關(guān)性Fig 4 Relationship between expression of CAIX with Ki67 in NSCLC

乏氧是導(dǎo)致實體腫瘤治療抵抗的重要原因，我們進一步研究了CAIX表達與NSCLC放療療效的相關(guān)性。近來的研究[8]表明NSCLC患者CAIX表達與生存期相關(guān)，但尚無研究分析其與治療療效的關(guān)系，我們的研究發(fā)現(xiàn)放療療效的客觀反應(yīng)率在CAIX表達陽性組和陰性組之間的差異有統(tǒng)計學意義，國外研究[10]發(fā)現(xiàn)在頭頸部鱗癌中CAIX表達與放療療效具有相關(guān)性，本研究顯示CAIX陰性組的客觀反應(yīng)率明顯高于CAIX陽性組，提示CAIX表達陽性對放療療效可能存在一定的預(yù)測作用，由于CAIX表達與乏氧代謝的密切相關(guān)性，本研究為乏氧增加NSCLC的放療抵抗提供了新的證據(jù)。

乏氧可使腫瘤細胞的一些基因和蛋白的表達發(fā)生改變，包括CAIX、VEGF在內(nèi)的多個基因表達的上調(diào)[11]。在Kim的研究[8]中，使用RT-PCR技術(shù)檢測了74例早期NSCLC患者的術(shù)后切除標本中CAIX和VEGF的表達，發(fā)現(xiàn)CAIX mRNA的表達與VEGF mRNA呈正相關(guān)（P=0.002），本研究發(fā)現(xiàn)CAIX蛋白表達與VEGF蛋白表達呈正相關(guān)，與Kim的研究結(jié)論一致，提示在NSCLC中VEGF的表達可能與乏氧相關(guān)。CAIX與VEGF表達的正相關(guān)關(guān)系可能是由于它們結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈均存在一個乏氧反應(yīng)元件（hypoxia-responsive element, HRE），可以在乏氧的條件下被激活，從而使表達共同上調(diào)[12]，而不是線性的激活與被激活的關(guān)系。多個研究[13,14]表明在腎癌、乳腺癌中CAIX的表達與Ki67表達相關(guān)，但我們的研究卻發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者中CAIX表達與Ki67表達差異無統(tǒng)計學意義，在Kim的另外一個研究[15]中也發(fā)現(xiàn)在75例NSCLC患者中CAIX表達與Ki67表達差異無統(tǒng)計學意義，但對CAIX高表達的30例患者分析發(fā)現(xiàn)，CAIX染色陽性區(qū)域較陰性區(qū)域有更高比例的Ki67表達，提示CAIX表達有助于腫瘤細胞的增殖，本研究因CAIX（+++）表達例數(shù)僅10例，故未進行此項觀察。

本研究的結(jié)果表明：CAIX在NSCLC組織中表達較良性組織水平明顯上升，并與VEGF表達相關(guān)；CAIX蛋白表達與客觀反應(yīng)率相關(guān)，為乏氧增加NSCLC的放療抵抗提供了新的證據(jù)。