徐洪濤 王佐周 劉娣 李慶昌 戴順東 王恩華

作者單位：110001 沈陽(yáng)，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室（通訊作者：徐洪濤，E-mail: xu.htao@yahoo.com.cn）

DNA甲基化是導(dǎo)致抑癌基因失活和腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要表觀遺傳學(xué)因素，在肺癌中已發(fā)現(xiàn)CDH1（E-cadherin）、p16、p53、PTEN、RB等多種抑癌基因的甲基化[1]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1,DNMT1）是調(diào)控CpG二核苷酸中胞嘧啶甲基化的重要分子之一，研究表明，DNMT1的異常表達(dá)與結(jié)腸癌[2]、乳腺癌[3]、胰腺癌[4]等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但目前有關(guān)DNMT1在肺癌中表達(dá)和作用的研究尚處于起步階段，DNMT1在肺鱗癌、腺癌中的表達(dá)情況和意義尚不明確。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）作為細(xì)胞粘附和Wnt通路的關(guān)鍵分子，與肺癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[5]。而DNMT1與β-catenin在肺癌中是否存在某些聯(lián)系和相互作用尚不明確。為此，本研究采用組織芯片和免疫組化方法檢測(cè)DNMT1在肺鱗癌、腺癌和癌旁正常肺組織中的表達(dá)情況，分析闡明DNMT1在正常肺組織和肺癌組織中表達(dá)的差異及其與肺鱗癌和腺癌臨床病理因素的關(guān)系，并探討DNMT1與β-catenin在肺癌中表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例與標(biāo)本 84例肺鱗癌、腺癌和相對(duì)應(yīng)的84例癌旁正常肺組織標(biāo)本取自上海芯超生物科技有限公司組織庫(kù)存檔標(biāo)本（由醫(yī)院合作方提供），癌旁正常肺組織的取材部位距離癌灶1 cm-2 cm，由上海芯超公司的病理專家根據(jù)WHO（2004年）肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)復(fù)診確認(rèn)并制備組織芯片（陣列編號(hào)：OD-CT-RsLug01-002），每例標(biāo)本直徑1.0 mm。根據(jù)存檔資料，患者平均年齡（61.21±11.74）歲（20歲-81歲）（3例年齡信息缺失），男性49例，女性33例（2例性別信息缺失），術(shù)前均未接受放化療。肺癌組織根據(jù)WHO（2004年）肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)分為鱗癌37例（包括高分化14例、中分化14例、低分化9例）；腺癌47例（包括高分化12例、中分化27例、低分化8例），75例腫瘤最大直徑≥3 cm，35例存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.1.2 試劑 鼠抗人DNMT1單克隆抗體（sc-70981）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司，鼠抗人β-catenin單克隆抗體（610153）購(gòu)自美國(guó)BD Transduction Laboratories，SP超敏免疫組化試劑盒（KIT-9710）和DAB酶底物顯色試劑盒（DAB-0031）均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2 方法 將組織芯片標(biāo)簽向上并傾斜一定角度，置于60oC烤箱中3 h，融掉表面封蠟，經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，0.1%枸櫞酸緩沖液（pH 6.0-6.2）中高溫高壓修復(fù)1.5 min，山羊血清37oC封閉20 min，滴加鼠抗人DNMT1一抗（1:200）或鼠抗人β-catenin一抗（1:200），4oC過夜后，依次加入生物素標(biāo)記二抗和鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶，分別于37oC下孵育30 min，DAB顯色后蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以組織芯片中癌旁正常肺組織作為內(nèi)對(duì)照，以PBS取代一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定：免疫組化染色后，組織芯片中組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較完好、能夠進(jìn)行細(xì)胞染色陽(yáng)性判定和計(jì)數(shù)的標(biāo)本為有效病例。芯片中每一例組織標(biāo)本直徑為1.0 mm，所以能夠在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)每一例有效病例的瘤細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性瘤細(xì)胞數(shù)，得出每例標(biāo)本DNMT1和β-catenin表達(dá)的陽(yáng)性率，并計(jì)算出DNMT1在肺癌組織中的平均陽(yáng)性率。刪除因掉片脫點(diǎn)而無(wú)法計(jì)數(shù)的病例。本研究中，DNMT1在肺癌組織中的平均陽(yáng)性率為（58.04±35.07）%（n=84），所以將陽(yáng)性率≥58%定為DNMT1高表達(dá)，陽(yáng)性率＜58%或陰性定為DNMT1低表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析DNMT1的表達(dá)在肺癌組織和癌旁正常肺組織間的差異；采用卡方檢驗(yàn)、似然比法和Spearman等級(jí)相關(guān)分析DNMT1的表達(dá)與肺鱗癌和腺癌臨床病理因素的關(guān)系；采用Pearson相關(guān)分析DNMT與β-catenin表達(dá)的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNMT1在肺鱗癌和腺癌中的表達(dá)顯著高于癌旁正常肺組織 DNMT1免疫組化染色后，詳細(xì)計(jì)數(shù)每一例肺癌和癌旁正常肺組織中DNMT1的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算出陽(yáng)性表達(dá)率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，84例癌旁正常肺組織中，有43例出現(xiàn)DNMT1在少數(shù)上皮細(xì)胞漿中的微弱表達(dá)，平均陽(yáng)性表達(dá)率為（6.88±10.26）%（n=84），而在84例肺鱗癌和腺癌組織中，75例（89.29%）存在不同程度的DNMT1細(xì)胞漿（伴或不伴有細(xì)胞核）表達(dá)，平均陽(yáng)性表達(dá)率為（58.04±35.07）%（n=84），顯著高于癌旁正常肺組織（t=12.835, P＜0.001）（圖1，表1）。

2.2 DNMT1的高表達(dá)與肺鱗癌和腺癌的分型、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān) 根據(jù)DNMT1高、低表達(dá)的判定標(biāo)準(zhǔn)，肺癌中有53例（63.10%）為DNMT1高表達(dá)，31例（36.90%）為DNMT1低表達(dá)。如表2所示，DNMT1在肺腺癌中的高表達(dá)率（37/47, 78.72%）顯著高于肺鱗癌（16/37, 43.24%）（P=0.001）；在中低分化肺癌中的高表達(dá)率（41/58, 70.69%）顯著高于高分化肺癌（12/26,46.15%）（P=0.021）；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中的高表達(dá)率（27/35, 77.14%）顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例（26/49, 53.06%）（P=0.024），而且DNMT1的表達(dá)在不同性別（P=0.018）、不同年齡段（P=0.023）的病例間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但本研究未發(fā)現(xiàn)DNMT1的表達(dá)與腫瘤大小之間的關(guān)系（P=0.623）。進(jìn)一步的Spearman等級(jí)相關(guān)分析也表明DNMT1的高表達(dá)與肺癌的組織學(xué)類型（r=0.365, P=0.001）、分化程度（r=0.253, P=0.021）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（r=0.246, P=0.024）、性別（r=0.262, P=0.017）和年齡（r=-0.253, P=0.022）相關(guān)。

圖 1 DNMT1和β-catenin在肺鱗癌、腺癌和癌旁正常肺組織中的表達(dá)（×400）。A：DNMT1在癌旁正常肺組織中陰性表達(dá)；B、C：DNMT1在肺鱗癌（B）和肺腺癌（C）中的細(xì)胞漿和細(xì)胞核表達(dá)；D： β-catenin在癌旁正常肺組織中的膜表達(dá)；E：β-catenin在肺鱗癌中的細(xì)胞漿和細(xì)胞核表達(dá)；F：β-catenin在肺腺癌中的細(xì)胞漿表達(dá)。Fig 1 The expressions of DNMT1 and β-catenin in lung squamous cell carcinoma, adenocarcinoma and corresponding normal lung tissues (×400).A: The negative expression of DNMT1 in corresponding normal lung tissue; B, C: The cytoplasmic-nuclear expression of DNMT1 in lung squamous cell carcinoma (B) and adenocarcinoma (C); D: The membranous expression of β-catenin in corresponding normal lung tissue; E: The cytoplasmicnuclear expression of β-catenin in lung squamous cell carcinoma; F: The cytoplasmic expression of β-catenin in lung adenocarcinoma.

表 1 DNMT1在肺癌和癌旁正常肺組織中的表達(dá)Tab 1 The expression of DNMT1 in lung cancer and corresponding normal lung tissues

2.3 DNMT1的表達(dá)與β-catenin的細(xì)胞漿表達(dá)相關(guān) β-catenin免疫組化染色后，組織芯片中獲得有效病例77例。所有肺鱗癌和腺癌病例中均不同程度地出現(xiàn)了β-catenin的細(xì)胞漿表達(dá)，其平均表達(dá)率為（69.74±27.14）%，其中28例伴有不同程度的細(xì)胞膜表達(dá)（36.37%），7例伴有細(xì)胞核表達(dá)（9.09%）。β-catenin的細(xì)胞漿表達(dá)與肺癌的組織分型（r=0.301, P＜0.008）、腫瘤大?。╮=0.204, P＜0.037）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（r=0.278, P＜0.014）相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)β-catenin細(xì)胞膜和細(xì)胞核表達(dá)與肺癌臨床病理因素的相關(guān)性，因已有大量關(guān)于β-catenin在肺癌中表達(dá)和意義的報(bào)道[5-7]，為避免重復(fù)，本研究對(duì)β-catenin與肺癌臨床病理因素的相關(guān)性不再贅述。經(jīng)Pearson相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)DNMT1與β-catenin的細(xì)胞漿表達(dá)顯著相關(guān)（r=0.571, P＜0.001）（圖1），而與β-catenin的細(xì)胞膜（r=0.117, P=0.311）和細(xì)胞核表達(dá)（r=0.017, P=0.885）無(wú)明顯相關(guān)性。

表 2 DNMT1的表達(dá)與肺鱗癌和腺癌臨床病理因素的關(guān)系Tab 2 Relationships between DNMT1 expression and clinicopathologic characteristics of lung squamous carcinoma and adenocarcinoma

3 討論

肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一，肺癌患者的死亡率在工業(yè)化國(guó)家中居惡性腫瘤之首[8]。抑癌基因的甲基化是肺癌發(fā)生和發(fā)展的重要原因之一，大量研究[1]表明肺癌中經(jīng)常出現(xiàn)CDH1、p16、p53、PTEN、RB、APC[9]等多種抑癌基因的甲基化和失活。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是調(diào)控CpG二核苷酸中胞嘧啶甲基化的關(guān)鍵分子，分為DNMT1、DNMT2和DNMT3三個(gè)亞家族，DNMT3又可分為DNMT3A和DNMT3B，它們不僅對(duì)維持染色體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、保障基因組表觀遺傳信息在親代細(xì)胞間的正確傳遞有重要作用，還與結(jié)腸癌[2]、乳腺癌[3]、胰腺癌[4]、肺癌[10]等多種惡性腫瘤中抑癌基因的甲基化、失活和腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。目前研究[1]表明DNMT1是在肺癌中起主要作用的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶亞型。

為深入探討DNMT1與肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，本研究首先檢測(cè)了DNMT1在肺癌和癌旁正常肺組織中表達(dá)的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在84例癌旁正常肺組織中，只有約半數(shù)的肺組織（43例）中出現(xiàn)微量的DNMT1表達(dá)，平均表達(dá)率僅為（6.88±10.26）%，說(shuō)明在正常肺組織中DNMT1處于低水平狀態(tài)，只有少數(shù)上皮細(xì)胞表達(dá)。而肺癌組織中，有89.29%的病例出現(xiàn)DNMT1不同程度的表達(dá)，平均表達(dá)率為（58.04±35.07）%，顯著高于癌旁正常肺組織（P＜0.001），說(shuō)明DNMT1的高表達(dá)在肺癌中是普遍現(xiàn)象，這種大大超過正常水平的DNMT1的表達(dá)量，可能是導(dǎo)致大量抑癌基因甲基化、失活和肺癌形成、發(fā)展并侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因之一。那么，DNMT1的高表達(dá)與肺癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的具體關(guān)系如何呢？為此，本研究詳細(xì)分析了DNMT1與肺癌臨床病理因素的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNMT1的高表達(dá)與肺癌的組織學(xué)分型、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著的相關(guān)性，提示DNMT1的表達(dá)情況有可能為判斷腫瘤類型、惡性程度和預(yù)后提供重要的信息。與本研究結(jié)果相似，在結(jié)腸癌[2]、胰腺癌[4]、肝細(xì)胞癌[11]和粘液表皮樣癌[12]等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)DNMT1的表達(dá)水平有明顯升高，并不同程度地與腫瘤的分化程度、臨床分期或（和）預(yù)后不良相關(guān)。Lin等[10]發(fā)現(xiàn)DNMT1在肺癌中的表達(dá)顯著，并與吸煙患者的預(yù)后不良相關(guān)，進(jìn)一步的研究[13]表明吸煙將導(dǎo)致DNMT1降解失調(diào)并在細(xì)胞漿、核內(nèi)蓄積，進(jìn)而誘導(dǎo)抑癌基因甲基化和腫瘤的形成。本研究發(fā)現(xiàn)DNMT1的高表達(dá)與女性患者、肺腺癌相關(guān)，與此相似，Lin等[14]發(fā)現(xiàn)DNMT3b的高表達(dá)更常出現(xiàn)在腺癌組織和女性患者中，這可能與雌激素水平或腺癌病例中女性比例較高有關(guān)，其原因有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

β-catenin是Wnt通路的關(guān)鍵分子和重要的粘附分子，在正常上皮組織中定位于細(xì)胞膜，而在腫瘤中常出現(xiàn)異常的細(xì)胞漿和細(xì)胞核蓄積，并與Wnt通路的活化以及c-myc、Cyclin D1等靶基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)，以往的研究[5-7,15]表明β-catenin異常蓄積與肺癌的惡性表型和預(yù)后不良密切相關(guān)。本研究首次發(fā)現(xiàn)DNMT1與β-catenin的細(xì)胞漿表達(dá)呈顯著正相關(guān)，這表明它們二者之間存在著直接或間接的相互協(xié)同作用。有研究[9,16]表明，腫瘤中存在著Wnt通路負(fù)調(diào)控基因的甲基化，DNMT1可能通過Axin、APC等基因的甲基化，促進(jìn)了β-catenin的失調(diào)控和蓄積，另外，β-catenin也可能通過多種靶基因產(chǎn)物直接或間接地促進(jìn)DNMT1的表達(dá)，二者可能具有相互調(diào)控、相互協(xié)同，共同促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。這一現(xiàn)象為深入研究肺癌中DNMT1與Wnt通路的調(diào)控機(jī)制開拓了新的方向。

綜上所述，DNMT1的高表達(dá)是肺鱗癌和腺癌的普遍現(xiàn)象；DNMT1的高表達(dá)與肺癌的腺癌組織學(xué)類型、低分化和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；DNMT1與β-catenin的細(xì)胞漿表達(dá)呈顯著正相關(guān)。深入研究DNMT1在肺癌中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制將有可能為肺癌的早期診斷和基因靶向治療提供新的線索和思路。