高赟 蘇丹 應(yīng)莉莎 呂汪霞 馬勝林

作者單位：310022 杭州，浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所（高赟，蘇丹，應(yīng)莉莎）；310022 杭州，浙江省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（呂汪霞，馬勝林）（通訊作者：馬勝林， ，E-mail : mashenglin@medmail. com. cn）

肺癌目前的發(fā)病率和死亡率在我國男性中均較高，約65%的肺癌患者確診時(shí)已屬晚期，失去了手術(shù)機(jī)會?；熢诜伟┑木C合治療中占有重要地位，但多藥耐藥是影響其療效的主要障礙。越來越多的研究[1-3]表明，切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因 1 （excision repair cross complementing gene 1, ERCC1）表達(dá)水平與腫瘤順鉑 （cisplatin, DDP）耐藥以及肺癌患者生存時(shí)間相關(guān)。RNA干擾（RNA interference, RNAi）技術(shù)是近年來較為熱門的一種研究基因功能和進(jìn)行基因治療的新方法。本研究擬通過RNA干擾技術(shù)降低ERCC1基因的表達(dá)，探討干擾前后人肺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP對順鉑的敏感性變化，為克服肺癌順鉑耐藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP由同濟(jì)大學(xué)上海肺科醫(yī)院周彩存教授惠贈，在含15%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37oC、5%CO2。

1.1.2 試劑與儀器 siRNA由Ambion公司設(shè)計(jì)合成；陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000、Trizol購于Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑購于Promega公司，熒光PCR試劑購于Bioer公司，其它試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。7700熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品；多功能酶標(biāo)儀為thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計(jì)、合成 由Ambion公司完成。

1.2.2 轉(zhuǎn)染 采用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。當(dāng)A549/DDP細(xì)胞融合30%-50%（此時(shí)細(xì)胞處于對數(shù)生長期，狀態(tài)最佳）在6孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染步驟按說明書操作。

1.2.3 RT-PCR檢測RNAi后A549/DDP細(xì)胞ERCC1基因和GAPDH基因的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后每組分別收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以GAPDH為內(nèi)參照擴(kuò)增ERCC1基因。擴(kuò)增條件為：95oC預(yù)變性10 min，95oC變性15 s，60oC退火45 s，72oC延伸45 s，40個循環(huán)后72oC延伸10 min。PCR產(chǎn)物作溶解曲線分析是否為引物二聚體。根據(jù)Ct值進(jìn)行相對定量分析，各組ERCC1 mRNA相對表達(dá)量以相對于未轉(zhuǎn)染組的倍數(shù)2-ΔΔCt表示，ΔCt=CtERCC1-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCtRNAi組-ΔCt脂質(zhì)體組，抑制效率=1-2-ΔΔCt。

1.2.4 Western blot檢測RNAi前后A549/DDP細(xì)胞ERCC1蛋白表達(dá)水平變化 收集對數(shù)生長期A549和A549/DDP細(xì)胞，用1 mL 1×PBS收集下來后在4oC、2 000 rpm轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄去上清。加入適量的含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液。在冰上用細(xì)胞超聲粉碎儀進(jìn)行超聲裂解直至細(xì)胞液變成澄清透明，4oC、13 000 rpm轉(zhuǎn)速下離心30 min。將上清轉(zhuǎn)移至新管，用5×SDS電泳樣品緩沖液在沸水中煮沸5 min變性，-20oC保存?zhèn)溆谩CA蛋白濃度測定試劑盒檢測收集的蛋白濃度，蛋白上樣量為30 μg每孔，依次進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜、封閉及抗體孵育、顯影。Bio-Rad公司Quantity One軟件分析轉(zhuǎn)染組與對照組蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.2.5 MTT法檢測RNAi后A549/DDP細(xì)胞對順鉑敏感性的變化 取對數(shù)生長期的A549/DDP細(xì)胞，以4×103/孔接種于96孔板上，24 h后換成無血清1640培養(yǎng)液，48 h后按說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染8 h后加入不同濃度順鉑（終濃度分別為32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入5 mg/mL四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）20 μL，4 h后加DMSO震蕩10 min，酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度，計(jì)算半數(shù)抑制量（IC50）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)使用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNAi后A549/DDP細(xì)胞ERCC1基因的表達(dá)變化 根據(jù)2-ΔΔCt值的大小，得到三組細(xì)胞ERCC1基因表達(dá)的相對差異（圖1）。與脂質(zhì)體組相比，RNA干擾組細(xì)胞ERCC1基因表達(dá)降低，其中針對ERCC1基因第346核苷酸設(shè)計(jì)的siRNA（RNAi 1組）干擾效率要高于針對第281核苷酸設(shè)計(jì)的siRNA（RNAi 2組）。

2.2 RNAi后A549/DDP細(xì)胞ERCC1蛋白表達(dá)水平改變 轉(zhuǎn)染前，A549/DDP細(xì)胞中ERCC1蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度為0.710±0.057，轉(zhuǎn)染ERCC1 siRNA后降為0.495±0.102，ERCC1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）（圖2）。

2.3 RNAi后A549/DDP細(xì)胞對順鉑敏感性的變化 轉(zhuǎn)染ERCC1 siRNA后，RNAi組A549/DDP細(xì)胞對順鉑的IC50值為9.27 μg/mL，對照組細(xì)胞的IC50值為12.49 μg/mL，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對順鉑的敏感性增加了1.35倍。RNAi組和對照組細(xì)胞的抑制率見圖3。

表1 針對靶基因ERCC1 mRNA設(shè)計(jì)2對siRNA序列Tab 1 Two pairs of ERCC1 siRNAsequences designed according to target gene ERCC1 mRNA

圖 1 不同siRNA對ERCC1基因表達(dá)的抑制效率Fig 1 The inhibition rates of two siRNAs on the expression of ERCC1 gene. *: P＜0.05, vs control.

圖 2 A549/DDP轉(zhuǎn)染ERCC1 siRNA前后ERCC1蛋白表達(dá)水平的變化Fig 2 ERCC1 protein expression levels of A549/DDP before and after transfection with siRNA ERCC1

圖 3 不同濃度順鉑對RNA干擾后A549/DDP細(xì)胞的抑制率Fig 3 The effect of cisplatin on A549/DDP cell proliferation transfected by siRNA. *P＜0.05, vs control.

3 討論

化療在肺癌的治療中占有重要地位，單藥化療中最有效的是DDP，目前最常以DDP為基礎(chǔ)組成聯(lián)合方案。耐藥是影響化療療效和肺癌患者生存率的主要原因。目前研究[4-7]認(rèn)為順鉑耐藥機(jī)制主要包括：藥物外排增加、耐藥相關(guān)基因的改變、DNA損傷修復(fù)功能增強(qiáng)、細(xì)胞凋亡受抑制等。其中，DNA損傷修復(fù)功能是肺癌順鉑耐藥機(jī)制研究及肺癌個體化治療的熱點(diǎn)。DNA修復(fù)主要存在5種途徑：核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair,NER）、錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、同源NER重組修復(fù)和非同源末端連接。其中NER可切除修復(fù)各種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的DNA損傷，特別是在龐大的DNA共價(jià)損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用，比如紫外線照射誘發(fā)的嘧啶二聚體、多環(huán)芳香碳?xì)浠衔?、氧化損傷以及鉑類藥物所致的DNA損傷。ERCC1、ERCC2、ERCC3等20多種蛋白參與其中，而DNA損傷的識別/切除是限速步驟，使得在該步驟中起主導(dǎo)作用的ERCC1最為引人矚目，其功能活性的高低可反映整個NER修復(fù)活性的水平[8]。

目前，有效抑制基因表達(dá)的方法主要有：基因敲除[9]、反義核苷酸技術(shù)[10]和RNAi技術(shù)[11,12]。其中，RNAi技術(shù)比基因敲除技術(shù)易于操作，而且基因抑制效果好于反義核苷酸技術(shù)。將與mRNA序列對應(yīng)的正義和反義RNA組成的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞，可以使RNA降解和基因沉默，這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing, PTGS）被稱為RNAi[13,14]。siRNA的設(shè)計(jì)是RNAi技術(shù)成敗的關(guān)鍵。根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成2對siRNA序列。通過篩選，我們認(rèn)為針對ERCC1基因346核苷酸設(shè)計(jì)的siRNA能更有效地抑制該基因表達(dá)，抑制效率更高。RT-PCR和Western blot結(jié)果均證明，轉(zhuǎn)染ERCC1 siRNA后，與對照組相比人肺腺癌細(xì)胞株A549/DDP細(xì)胞ERCC1基因和蛋白表達(dá)水平明顯降低，表明通過RNAi后ERCC1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯均被抑制。

A549/DDP細(xì)胞是用小劑量DDP作為誘導(dǎo)劑、對人肺腺癌細(xì)胞A549進(jìn)行逐步長期誘導(dǎo)而建立的耐DDP人肺腺癌細(xì)胞株。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在一定的劑量范圍內(nèi)，隨著DDP濃度的升高，順鉑對RNAi后A549/DDP細(xì)胞的抑制率增加，研究證實(shí)降低ERCC1基因表達(dá)水平可以提高鉑類藥物化療敏感性，ERCC1可以作為肺癌個體化治療時(shí)是否選擇順鉑的預(yù)測指標(biāo)之一。應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)誘導(dǎo)ERCC1基因表達(dá)下調(diào)，可增加肺癌細(xì)胞等腫瘤對鉑類藥物的敏感性，具有一定的臨床潛在應(yīng)用價(jià)值，為今后非小細(xì)胞肺癌的個體化治療提供了一定的理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)DDP濃度達(dá)到一定的劑量后抑制率反而降低，我們認(rèn)為RNAi技術(shù)對ERCC1基因的不完全抑制及其它耐藥機(jī)制的存在導(dǎo)致了A549/DDP細(xì)胞耐藥逆轉(zhuǎn)的不徹底性。另外，腫瘤耐藥不是單基因作用的結(jié)果，還有其它因素的參與，封閉單個基因不能完全逆轉(zhuǎn)耐藥。因此，ERCC1 siRNA可作為治療肺癌耐藥的新策略，但是其逆轉(zhuǎn)耐藥的不徹底性仍是需要克服的主要問題，使用多基因多靶點(diǎn)siRNA可能是一種可行的選擇。