朱志圖 郁云龍 王鍇 李恩澤 劉陽陽 劉云鵬

作者單位：121001 錦州，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腫瘤科（朱志圖，郁云龍，王鍇，李恩澤，劉陽陽）；110001 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院腫瘤內(nèi)科（劉云鵬）（通訊作者：郁云龍，E-mail:yunlong615@163.com）

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）約占肺癌總數(shù)的80%-85%，而其中近1/3的患者初次確診時(shí)已為局部晚期[1]，多數(shù)NSCLC患者可能在其病程的不同時(shí)期需要接受藥物化療。常用抗腫瘤藥物的臨床療效有限，且抗瘤藥物的諸多毒副作用如骨髓抑制、消化道反應(yīng)等會(huì)嚴(yán)重影響腫瘤患者對(duì)化療的耐受性和依從性。因此，尋找高效低毒的治療藥物成為近年來腫瘤基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。蟾蜍靈（Bufalin）是從中藥蟾酥中提取出來的有效成分之一，體外實(shí)驗(yàn)和部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[2,3]發(fā)現(xiàn)，蟾蜍靈可以選擇性地誘導(dǎo)一系列不同來源的腫瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常宿主細(xì)胞無明顯殺傷作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們研究了蟾蜍靈對(duì)NSCLC細(xì)胞株A549的誘導(dǎo)凋亡作用及其可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 蟾蜍靈、碘化丙錠（propidium iodide,PI）、核糖核酸酶（ribonucleic acid enzyme, RNAse）、F12K培養(yǎng)基購于Sigma公司；胎牛血清購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所；兔抗人Caspase-3、β-actin抗體購于Santa Cruz公司；兔抗人Livin抗體購于博士德生物工程有限公司；羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）購于北京華美公司。將蟾蜍靈用無水乙醇配制成10 mmol/L的儲(chǔ)存液，-20oC貯存。實(shí)驗(yàn)前用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline, PBS）稀釋，將乙醇終濃度控制在體積分?jǐn)?shù)＜0.01%。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，該濃度乙醇對(duì)細(xì)胞增殖無影響。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞株A549購于中科院上海細(xì)胞庫，置于含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)液中，37oC、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，0.25%胰酶消化液消化傳代，3天-4天傳代1次。所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 MTT法進(jìn)行細(xì)胞活力檢測 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)至2×104/mL-10×104/mL接種于96孔板，每孔180 μL，培養(yǎng)過夜后分別加入終濃度為10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L的蟾蜍靈，空白組和對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為200 μL。加藥分別培養(yǎng)48 h、72 h和96 h，終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，到預(yù)定時(shí)間后吸去上清，每孔加入200 μL DMSO，振蕩搖勻。用酶標(biāo)儀于570 nm波長條件下測定吸光度。按下列公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率: 增殖抑制率（%）=1-（處理組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值）/（對(duì)照組平均OD值-空白對(duì)照組平均OD值）×100%。計(jì)算蟾蜍靈抑制細(xì)胞增殖50%的藥物濃度（IC50），并繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。

1.4 瑞氏-吉姆薩染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化 40 nmol/L蟾蜍靈作用細(xì)胞48 h后分別收集對(duì)照組及處理組細(xì)胞，2 000 r/min離心機(jī)甩片3 min制成細(xì)胞涂片，用瑞氏-吉姆薩染液染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布及凋亡情況 用20 nmol/L、40 nmol/L、100 nmol/L蟾蜍靈分別作用細(xì)胞48 h、72 h，胰酶消化后收集細(xì)胞1 000 r/min離心5 min，冷PBS洗滌，加入70%的冷乙醇4oC過夜，PBS再次離心洗滌，加入RNAse（10 μg/mL）37oC孵育30 min后，加入終濃度為10 μg/mL的PI，避光反應(yīng)30 min后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量測定，采用Cell Quest軟件進(jìn)行細(xì)胞各周期的百分比分析，同時(shí)判定凋亡細(xì)胞百分率。

1.6 Western blot方法檢測Livin、Caspase-3蛋白表達(dá)水平 將對(duì)照組和蟾蜍靈作用后的細(xì)胞裂解于RIPA裂解液中，冰上裂解40 min后，12 000 r/min離心20 min，取上清，采用Lowry法進(jìn)行蛋白定量。與3×樣品緩沖液混合后煮沸5 min。將蛋白樣品（50 μg/lane）在15%的SDS-聚丙烯凝膠中電泳約3 h，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上90 min。用5%脫脂奶粉封閉1 h后，按預(yù)染Marker標(biāo)記的分子量剪裁轉(zhuǎn)印膜，分別加入Livin抗體（1:300）、Caspase-3（1:1 000）抗體及β-actin抗體（1:1 000），過夜。TTBS洗4次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:800）作用30 min，ECL法顯色后GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照并分析處理。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以Mean±SD表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蟾蜍靈明顯抑制A549細(xì)胞增殖 10 nmol/L-200 nmol/L蟾蜍靈分別作用A549細(xì)胞48 h、72 h及96 h，MTT結(jié)果顯示，蟾蜍靈抑制細(xì)胞增殖呈時(shí)間、劑量依賴關(guān)系。48 h、72 h及96 h的IC50值分別為（56.14±6.72）nmol/L、（15.57±4.28）nmol/L及（7.39±4.16）nmol/L（圖1）。

2.2 蟾蜍靈作用A549細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)變化 用40 nmol/L蟾蜍靈作用A549細(xì)胞48 h后，瑞氏-吉姆薩染色，光鏡下可以觀察到細(xì)胞染色質(zhì)固縮、胞核碎裂及凋亡小體形成等典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)（圖2）。

2.3 蟾蜍靈誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡 20 nmol/L、40 nmol/L、100 nmol/L蟾蜍靈分別作用細(xì)胞48 h及72 h后，流式細(xì)胞儀檢測顯示形成明顯的亞二倍體凋亡峰（sub-G1峰），亞二倍體細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（細(xì)胞凋亡率）48 h分別為（2.93±0.67）%、（4.86±1.26）%及（7.34±1.85）%；72 h分別為（4.64±0.74）%、（9.86±1.63）%及（18.05±1.58）%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）（圖3）， 其余細(xì)胞周期分布無明顯變化。

圖 1 細(xì)胞增殖抑制曲線Fig 1 The curve of cell proliferation inhibition

圖 2 蟾蜍靈對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響（瑞氏-吉姆薩染色，×400）。A：對(duì)照組；B：40 nmol/L。Fig 2 The effect of Bufalin on A549 cell morphology(Wright-Giemsa, ×400). A: Control; B: 40 nmol/L.

2.4 蟾蜍靈對(duì)Livin蛋白表達(dá)的影響 用20 nmol/L、40 nmol/L、100 nmol/L蟾蜍靈分別作用細(xì)胞48 h，Western blot檢測結(jié)果顯示，Livin蛋白表達(dá)分別下調(diào)至作用前的（61.29±7.76）%、（29.03±4.63）%及（22.17±6.02）%，與對(duì)照組比較其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）（圖4）。

2.5 蟾蜍靈對(duì)Caspase-3蛋白活化的影響 Western blot結(jié)果顯示，20 nmol/L蟾蜍靈作用細(xì)胞48 h僅檢測到非活化狀態(tài)32 kDa的Pro-Caspase-3，而40 nmol/L、100 nmol/L可檢測到Caspase-3的活化亞基（17 kDa），且隨濃度增大活化程度更明顯（圖5）。

3 討論

蟾蜍靈是中藥蟾酥的有效成分之一，國內(nèi)外學(xué)者的研究報(bào)道，蟾蜍靈可以誘導(dǎo)部分白血病細(xì)胞及實(shí)體瘤細(xì)胞分化及凋亡。Amano等[4]研究表明蟾蜍靈可以通過增加維生素D3受體而增強(qiáng)1,25(OH)2D3誘導(dǎo)髓樣白血病細(xì)胞分化的能力，為進(jìn)一步明確蟾蜍靈誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化提供了理論依據(jù)；Chen等[5]也通過基因表達(dá)圖譜驗(yàn)證了蟾蜍靈誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡過程中異常活化NF-kB及AP-1基因，但蟾蜍靈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的確切機(jī)理尚未闡明，目前研究認(rèn)為其作用機(jī)理與survivin、c-myc、WT1、AP-1等基因及MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)相關(guān)。本研究結(jié)果顯示蟾蜍靈可以時(shí)間、劑量依賴的方式抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，同時(shí)誘導(dǎo)其凋亡。實(shí)驗(yàn)研究表明許多抗癌藥物作用于腫瘤細(xì)胞，在低蟾蜍靈濃度、短時(shí)間時(shí)表現(xiàn)為周期阻滯，高濃度、長時(shí)間表現(xiàn)為凋亡。但目前關(guān)于蟾蜍靈引起細(xì)胞周期阻滯的報(bào)道不一，Li等[6]報(bào)道20 nmol/L蟾蜍靈作用胃癌MGC803細(xì)胞24 h后可引起明顯的G2/M期阻滯；但Nasu等[7]報(bào)道蟾蜍靈引起子宮內(nèi)膜異位基質(zhì)細(xì)胞G0/G1期阻滯。在本研究中，流式細(xì)胞儀分析顯示并未觀察到明顯的細(xì)胞周期阻滯，而是出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰，且經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色后亦可觀察到處理組細(xì)胞染色質(zhì)固縮、胞核碎裂及凋亡小體形成等典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)。這些結(jié)果提示蟾蜍靈作用于不同的細(xì)胞系可能引起不同的細(xì)胞周期分布，其對(duì)細(xì)胞周期阻滯的影響可能存在細(xì)胞特異性。

圖 3 流式細(xì)胞儀檢測蟾蜍靈誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞。A：不同濃度蟾蜍靈培養(yǎng)A549細(xì)胞48 h及72 h；1：對(duì)照組（48 h）；2：20 nmol/L（48 h）；3：40 nmol/L（48 h）；4：100 nmol/L（48 h）；5：對(duì)照組（72 h）；6：20 nmol/L（72 h）；7：40 nmol/L（72 h）；8：100 nmol/L（72h）；B：蟾蜍靈誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（*：P＜0.01，與對(duì)照組比較）。Fig 3 Analysis of apoptosis induced by Bufalin in A549 cells by flow cytometry. A: A549 cells were cultured 48 h and 72 h with different concentrations;1: Control (48 h); 2: 20 nmol/L (48 h); 3: 40 nmol/L (48 h); 4: 100 nmol/L (48 h); 5: Control (72 h); 6: 20 nmol/L (72 h); 7: 40 nmol/L (72 h); 8: 100 nmol/L(72 h); B: Bufalin induces A549 cells apoptosis (Compared with control group,*: P＜0.01).

圖 4 蟾蜍靈對(duì)Livin蛋白表達(dá)的影響。1：對(duì)照組；2：20 nmol/L；3：40 nmol/L；4：100 nmol/L。Fig 4 The expressions of Livin protein after treatment with Bufalin. 1:Control; 2: 20 nmol/L; 3: 40 nmol/L; 4: 100 nmol/L.

圖 5 蟾蜍靈對(duì)Caspase-3蛋白活化的影響。1：對(duì)照組；2：20 nmol/L；3：40 nmol/L；4：100 nmol/L。Fig 5 The expressions of Caspase-3 protein after treatment with Bufalin. 1: Control; 2: 20 nmol/L; 3: 40 nmol/L; 4: 100 nmol/L.

凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein, IAP）家族是機(jī)體內(nèi)抗凋亡因子之一，在腫瘤的形成過程中發(fā)揮著重要作用。Livin作為IAP家族的新成員，近年來研究表明，Livin的過度表達(dá)預(yù)示著腫瘤惡性度高、生存期短和預(yù)后不良，并可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥的因素之一。在本實(shí)驗(yàn)中，蟾蜍靈誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過程中Livin蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，相對(duì)應(yīng)A549細(xì)胞的凋亡率隨之上升。目前的許多研究[8,9]已經(jīng)通過把Livin作為靶點(diǎn)，在分子水平上抑制其表達(dá)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并提高腫瘤細(xì)胞對(duì)促凋亡刺激的敏感性。

Caspases是一組天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的核心酶，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者。許多凋亡誘導(dǎo)劑可通過Caspase-3依賴的方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，40 nmol/L、100 nmol/L蟾蜍靈作用A549細(xì)胞48 h可檢測到Caspase-3（17 kDa）活化亞基，首次證實(shí)蟾蜍靈在誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過程中裂解活化Caspase-3，提示蟾蜍靈可通過Caspase-3依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

目前研究[10]認(rèn)為Livin主要是在蛋白水平通過BIR結(jié)構(gòu)域與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的下游效應(yīng)Caspases，即激活形式的Caspase-3和Caspase-7結(jié)合后抑制細(xì)胞凋亡。在Fas/Caspase-8誘導(dǎo)的死亡受體途徑中，Livin直接抑制該途徑中的核心酶Caspase-3發(fā)揮作用；而在另一條由細(xì)胞色素C（cytochrome c, Cyt-c）/凋亡蛋白活化因子1（apoptotic protease activating factor-1, Apaf-1）作用的線粒體途徑中，Livin也能與Caspase-9的前體蛋白及其激活形式結(jié)合或通過阻斷Caspase-3對(duì)Caspase-9前體蛋白的反饋激活從而產(chǎn)生抗凋亡的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，蟾蜍靈作用A549細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增加，Livin蛋白的表達(dá)分別下調(diào)，而同時(shí)亦檢測到Caspase-3蛋白的逐漸活化。由此可推測，蟾蜍靈作用肺癌A549細(xì)胞后，通過下調(diào)凋亡抑制蛋白Livin的表達(dá)，解除了IAP對(duì)Caspase-3的抑制，使Caspase-3蛋白裂解活化，即有活性的凋亡效應(yīng)蛋白Caspase-3（17 kDa）表達(dá)上調(diào)，凋亡率隨之增加，這同Livin具有抗凋亡作用的理論也是相吻合的。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，一定濃度的蟾蜍靈在體外對(duì)人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞有顯著的生長抑制作用，下調(diào)凋亡抑制蛋白Livin及活化Caspase-3是其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制之一，上述結(jié)果為蟾蜍靈進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供了一定的理論依據(jù)，但其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制有待今后進(jìn)一步的研究來不斷完善。