趙 平,黃誠胤,聶 濤

(1.重慶大學(xué)體育學(xué)院,重慶 400044;2.成都電子機械高等?？茖W(xué)校,四川 成都 610031)

運動訓(xùn)練對腦缺血再灌注后內(nèi)皮祖細胞的影響

趙 平1,黃誠胤1,聶 濤2

(1.重慶大學(xué)體育學(xué)院,重慶 400044;2.成都電子機械高等專科學(xué)校,四川 成都 610031)

目的:研究運動訓(xùn)練對大鼠大腦中動脈阻塞(MCAO)再灌注模型后外周血中 EPCs數(shù)量的影響。方法:雄性 SD大鼠參照Longa的方法改進,建立MCAO模型。將MCAO后小鼠隨機分為4組①正常對照組(同步飼養(yǎng));②假手術(shù)對照組;③手術(shù)對照組;④手術(shù) +運動訓(xùn)練組,每組均 18只鼠。結(jié)果:經(jīng)過缺血再灌注損傷后,手術(shù)對照組大鼠外周血 EPCs數(shù)量明顯升高,手術(shù) +運動組外周血中 EPCs數(shù)量在幾個時間點中呈現(xiàn)先上升后又降低的趨勢,表現(xiàn)為 2天數(shù)量與正常組并無差異,而 6天數(shù)量明顯上升,高于其他各組,12天數(shù)量又出現(xiàn)降低。結(jié)論:運動訓(xùn)練可增加大鼠MCAO后外周血 EPCs的數(shù)量,運動對促進 EPCs動員和歸巢的調(diào)節(jié)作用,可以減緩由于腦缺血損傷導(dǎo)致的危害。

運動訓(xùn)練;腦缺血再灌注損傷;內(nèi)皮祖細胞;血管新生

腦梗塞是一種高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的疾病,給家庭和社會帶來非常沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。它與惡性腫瘤及心臟病穩(wěn)居人類死亡原因的前三名,嚴重危害人類健康[1]。因此,積極探索對其切實有效的治療方法具有十分重要的社會和現(xiàn)實意義。國內(nèi)外已有研究成果,腦缺血損傷能夠啟動血管新生修復(fù)機制,同時運動訓(xùn)練后可以促進腦缺血的血管新生和預(yù)后。但是運動訓(xùn)練作為一種物理治療方法,其治療機制是復(fù)雜的。近年來,應(yīng)用康復(fù)訓(xùn)練治療急性缺血性腦血管疾病取得了良好的療效,大量動物實驗與臨床研究也針對其治療機理進行了探索,積累了不少經(jīng)驗成果[2]。本研究從 EPCs(endothelialprogenitor cells),這一和血管新生修復(fù)關(guān)系密切的干細胞入手,先對大鼠骨髓中 EPCs進行分離、培養(yǎng)和鑒定,將結(jié)果作為理論依據(jù),并以不同處理后大鼠的外周血作為研究對象,探討在運動訓(xùn)練刺激影響下腦缺血再灌注大鼠外周血中內(nèi)源性 EPCs數(shù)量的變化,為康復(fù)醫(yī)學(xué)在促進血管新生方面機理研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

主要試劑與動物:M199培養(yǎng)液 (HyClone,U.S. A),胎牛血清 FBS(HyClone,U.S.A),Percoll分離液(Pharmacia,U.S.A),山羊抗大鼠 CD31抗體(Santacruz,U.S.A),小鼠抗大鼠 VE-cadherin抗體(Santacruz,U.S.A),PBS緩沖液 (北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),青霉素 (北京鼎國生物),鏈霉素 (北京鼎國生物),Dil-標記的乙?；兔芏戎癉il-Ac -LDL(Biomedical Technologies,U.S.A),FITC-標記的荊豆凝集素 FITC-UEA-1(Sigma,Ger many)。健康成年 SD(Sprague-Dawley)大鼠,雄性,體重(250±30)g,清潔級,重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 骨髓單個核細胞的分離及 EPCs的培養(yǎng)及鑒定

選用健康清潔級雄性 SD大鼠進行頸椎脫臼法處死。準備好兩套已消毒的手術(shù)器械,用第 1套器械除去大鼠雙下肢腿部的皮膚,然后在盡量保持大鼠雙股骨和脛骨完整性的條件下,剪下大鼠雙下肢,并將剪下的股骨脛骨置于已消毒并盛有含雙抗溶液的 PBS緩沖液的燒杯中,轉(zhuǎn)移置于超凈工作臺上,并再用含雙抗溶液的 PBS緩沖液沖洗約 2-3次。然后在無菌條件下,用第 2套器械處理股骨脛骨上殘留的肌肉,用剪刀分別剪去股骨脛骨的兩端,暴露骨髓腔,在培養(yǎng)皿中加入約 5ml的含 10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基,用注射器從培養(yǎng)皿中吸取培養(yǎng)基,吹洗骨髓腔,直至骨髓腔內(nèi)細胞被吹出,骨髓腔變白。用吸管將培養(yǎng)皿中的細胞懸液吹打混勻,然后將懸液裝入離心管中離心 5min(1 000r/min),去上清液和脂肪層,取沉淀加入含 10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基制成細胞懸液,充分混勻,然后將懸液貼壁緩緩加入到預(yù)置有等體積 Percoll分離液(1.077g/ml)的離心管中(分離液應(yīng)放置于 4℃冰箱儲存,在實驗時提前取出,避光平衡至室溫),懸于上層, 2500r/min離心 20 min,管內(nèi)液體分為 4層,收集處于中部的云霧狀白膜層的單個核細胞于另一離心管中,用含 10%胎牛血清的 PBS緩沖液洗滌兩次,每次 1 500r/min,離心 10min棄去上清液。最后分別用誘導(dǎo)組M199培養(yǎng)液和對照組M199培養(yǎng)液重懸細胞。以2×104/cm2種植密度分別接種于預(yù)先有 Fn包被的24孔培養(yǎng)板中,置于 5%CO2,飽和濕度,37℃,pH7.2恒溫培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng),并于 3d后首次換液。用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)、生長情況。

1.3 動物分組與制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型(MCAO)

采用完全隨機設(shè)計的方法,將大鼠隨機分為四組,每組 18只。①正常對照組(同步飼養(yǎng));②假手術(shù)對照組;③手術(shù)對照組;④手術(shù) +運動訓(xùn)練組。采用血管內(nèi)線栓法阻斷 SD大鼠大腦中動脈血流,參照Longa[3]等建立的方法有所改進,建立缺血 -再灌注模型。由頸總動脈近分叉處插入栓子改為由頸外動脈插入栓子,拔出栓子后不影響頸內(nèi)動脈血供,更有利于大腦中動脈供血區(qū)血流的恢復(fù)。大鼠在造模手術(shù)清醒后1-2h內(nèi)即開始依據(jù) Zealonga等確定的 5級評分方法進行神經(jīng)功能評分:0分,正?；顒?1分,不能充分伸展右前肢;2分,向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分,向右側(cè)傾倒;4分,不能自發(fā)行走,意識障礙。將模型成功(2-3分)的大鼠用于實驗。

1.4 跑臺訓(xùn)練

所有手術(shù) +運動組大鼠在造模前經(jīng)歷 5-8m/ min、30min/d、2天的適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練[4]。動物再灌注后 24小時,手術(shù) +運動組予以跑臺 (型號:DSPT-202,立泰生物科技有限公司)訓(xùn)練:坡度 0.12m/min,每天 30min,每周 5天,連續(xù)訓(xùn)練 2周。對假手術(shù)對照組和手術(shù)對照組大鼠進行同樣抓取,但不進行跑臺干預(yù)。

1.5 流式細胞術(shù)檢測外周血 EPCs數(shù)量

將外周血經(jīng)紅細胞裂解液處理后,用 0.5%BSA -PBS制成單細胞懸液。吸取 100μl細胞懸液 (細胞濃度≥1×106個/ml)。加入 10μl FITC標記的小鼠抗大鼠 CD31抗體,同時非特異 IgG作為同型對照,室溫避光孵育 20 min。用 0.5%BSA-PBS洗滌 1-2次,洗掉未結(jié)合的抗體。VEGFR-2的檢測采用二抗間接標記進行。先加入特異的第一抗體,待反應(yīng)完全后洗去未結(jié)合抗體,再加入 PE標記的第二抗體,生成抗原 -抗體 -抗抗體復(fù)合物,用 0.5%BSA-PBS洗滌 1-2次,加入緩沖液重懸,4%多聚甲醛固定后,流式細胞儀檢測。檢測出的VEGFR-2及 CD31表達雙陽性的細胞,即被標記為 EPCs。

1.6 結(jié)果統(tǒng)計學(xué)分析

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 細胞形態(tài)學(xué)變化

在倒置顯微鏡下可見,第 7d左右,出現(xiàn) EPCs典型形態(tài)特征 --“集落”樣結(jié)構(gòu) (圖 1)。集落中央為圓形細胞群,周邊有梭形細胞伸展,并與其他細胞相連接,與原始血島相似。

圖 1 細胞誘導(dǎo)培養(yǎng) 7d后,倒置顯微鏡觀察到的集落形態(tài)(×40)

2.2 細胞表型分析

細胞被誘導(dǎo)培養(yǎng) 7d后,激光掃描共聚焦顯微鏡顯示(圖 2):DAPI藍染的細胞核 (圖 2A)、VE-cadherin +細胞 (圖 2B)、CD31+細胞 (圖 2C)以及 VE-cadherin+CD31+黃褐色雙熒光細胞 (圖 2D)。黃褐色雙熒光細胞表型符合 EPCs的表型特征。CD31+黃褐色雙熒光細胞(D)

圖 2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示:DAPI染細胞核(A)、VE-cadherin+細胞 (B)、CD31+細胞 (C)、VE-cadherin+

2.3 外周血中 EPCs數(shù)量的變化

不同分組的大鼠外周血中 EPCs的數(shù)量存在差異,并隨時間的變化產(chǎn)生波動。假手術(shù)對照組 EPCs的數(shù)量與該時間點正常組的 EPCs的數(shù)量差異不明顯,無統(tǒng)計學(xué)意義;手術(shù)對照組在 2d時外周血中 EPCs數(shù)量明顯升高,與手術(shù) +運動組及其他各組相比變化差異極其顯著(P<0.01),而此時手術(shù) +運動組與正常組和假手術(shù)對照組值無明顯差異;6d時,手術(shù) +運動組 EPCs數(shù)量上升,與手術(shù)對照組相比變化差異顯著(P<0.05),有統(tǒng)計學(xué)意義,且與正常組、假手術(shù)對照組相比差異極其顯著 (P<0.01);12d時,手術(shù) +運動組值下降,與正常組和假手術(shù)對照組比差異不明顯,無統(tǒng)計學(xué)意義,手術(shù)對照組與各組相比數(shù)值仍較高,差異極其顯著(P<0.01)。詳見表 1。

表 1 各組不同時間外周血中 EPCs所占的百分比(每時間點取樣

表 1 各組不同時間外周血中 EPCs所占的百分比(每時間點取樣

注:與正常組比較顯著差異＊＊P<0.01;與假手術(shù)對照組同期比較顯著差異▲▲P<0.01;與手術(shù)對照組同期比較顯著差異△P<0.05,△△P<0.01

3 結(jié)論

腦缺血會導(dǎo)致供血不足,而損傷部位的血管新生可以增加腦血流量,減少缺血損傷。有研究表明腦缺血等原因造成的腦損傷可能啟動血管生成機制。血管生成 (angiogenesis)存在兩種形式,一種稱為血管發(fā)生,由血管干細胞原位分化為血管內(nèi)皮干/祖細胞及內(nèi)皮細胞后形成新生血管;另一種稱為血管重生,從原來存在的血管基礎(chǔ)上通過出芽等形式生出新的,以毛細血管為主的血管系統(tǒng)的過程[5]。在血管新生的理論基礎(chǔ)上誕生出血管新生療法已成為治療包括動脈粥樣硬化、惡性腫瘤、心肌缺血等“血管生成相關(guān)疾病”(angiogenesis dependent diseases)[6]的重要方案[7]。該種方法的臨床實驗已有數(shù)十年歷史。起初研究是從生長因子基因?qū)氲闹委熜匝苄律６壳按罅垦芯勘砻魅毖該p傷修復(fù)與干細胞的遷移、增生、分化有著密切的關(guān)系,因此研究又進入 EPCs等干細胞移植的治療性血管形成階段。Asahara等[8]1997年首次報道在成人外周血單核細胞中分離出內(nèi)皮祖細胞。內(nèi)皮祖細胞不僅在胚胎階段參與血管發(fā)生,而且在出生后通過動員、遷移和分化等過程參與新生血管生成,在成體新生 血管中內(nèi)皮祖細胞來源的內(nèi)皮細胞占到25%[9]。

有研究顯示,骨髓 CD34-/VE-cadherin-/ CD133+/KDR+多潛能成年祖細胞是內(nèi)皮祖細胞的來源。骨髓中的內(nèi)皮祖細胞經(jīng)各種因素刺激后向外周血遷移,增加外周血中的內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量,稱為內(nèi)皮祖細胞的動員 (Mobilization)。在生理狀態(tài)下,外周血液中內(nèi)皮祖細胞的數(shù)量很少。在缺血損傷后,骨髓中的內(nèi)皮祖細胞可經(jīng)動員進入外周循環(huán),歸巢到缺血部位,從而促進缺血組織的血管新生[10],并可以通過分化為成熟內(nèi)皮細胞進行循環(huán)、增殖,參與血管網(wǎng)的形成[11]。國內(nèi)臨床研究證明康復(fù)訓(xùn)練可減輕梗死造成的腦組織結(jié)構(gòu)和功能的損傷,改善腦梗塞患者的功能[12-13],運動訓(xùn)練是康復(fù)醫(yī)學(xué)治療方法中的重要手段。近年來,越來越多的學(xué)者將目光轉(zhuǎn)移到了運動訓(xùn)練在腦損傷中的機制研究。孫莉敏研究中[14],對MCAO大鼠進行跑臺訓(xùn)練,2周后運動組腦梗死體積明顯小于對照組,同時進行了血管生成素檢測,手術(shù)加運動組血管生成素表達明顯高于假手術(shù)組和手術(shù)對照組,血管生成素的增高提示運動訓(xùn)練很有可能促進腦組織的血管生成。李玲等[15]對腦梗死大鼠進行抓握、平衡、旋轉(zhuǎn)、行走等訓(xùn)練,并用免疫組化方法標記細胞核抗原(PCNA),檢測細胞增生情況。發(fā)現(xiàn)在早期腦梗死大鼠梗死灶周圍可見膠質(zhì)細胞增生及周邊散在的小血管芽向壞死區(qū)生長并形成膠質(zhì)瘢痕,后期邊緣有明顯的血管和纖維母細胞增生,在梗死灶內(nèi)有肉芽和血管支架形成。

大量的研究數(shù)據(jù)證明:對腦缺血大鼠進行一定強度的運動訓(xùn)練可以明顯改善大鼠的運動功能并減小腦梗死體積。但是有關(guān)運動訓(xùn)練對骨髓 EPC動員到外周血的實驗研究目前見到的文獻報道較少,不同強度的運動訓(xùn)練是否能引起腦缺血后 EPC數(shù)量及活性表達發(fā)生不同的變化?目前尚未見到類似的研究報道。本研究選取大鼠中動脈閉塞 -再灌注模型作為研究缺血性腦血管病的基礎(chǔ)模型,對MCAO大鼠進行跑臺訓(xùn)練,并根據(jù)時間點對模型抽取外周血通過流式細胞術(shù)檢測 EPC數(shù)量。經(jīng)過缺血再灌注損傷后,手術(shù)對照組大鼠外周血 EPCs數(shù)量明顯升高,以 2d為峰值,6d、12d較 2d有所降低且 6d與 12d之間無統(tǒng)計學(xué)差異;而手術(shù) +運動組外周血中 EPCs數(shù)量在幾個時間點中呈現(xiàn)先上升后又降低的趨勢,表現(xiàn)為 2d數(shù)量與正常組并無差異,而 6d數(shù)量明顯上升,高于其他各組,12d數(shù)量又出現(xiàn)降低。手術(shù)對照組外周血中 EPCs出現(xiàn)上述變化與已有研究報道一致:在生理條件下,循環(huán)系統(tǒng)中EPCs僅占全部 PBMC的 0.03%～0.06%。在缺血損傷后,骨髓中的 EPCs可經(jīng)動員進入外周循環(huán),歸巢到缺血部位,促進缺血組織的血管新生[16]。Asahara等發(fā)現(xiàn)在燒傷或冠狀動脈旁路手術(shù)后 6-12h外周血中 EPCs水平增加近 50倍,在 48-72h后逐漸降至基線水平[17]。同時也有研究表明,腦缺血損傷初期還伴有炎癥反應(yīng),并在 24h到達高峰[18]?？梢?手術(shù)對照組外周血中 EPCs在 2d時的突增可能還與損傷造成的炎癥反應(yīng)有關(guān)。而模型組 6d和 12d較 2d數(shù)值雖有所降低,但仍處于較高狀態(tài),推測可能與腦缺血產(chǎn)生的持續(xù)損傷和炎癥反應(yīng)有關(guān)。手術(shù) +運動組外周血中EPCs數(shù)量的變化趨勢與手術(shù)組存在著明顯差異。本研究對運動訓(xùn)練調(diào)節(jié)外周血中循環(huán) EPCs的機制作如下推測:運動訓(xùn)練對 EPCs的調(diào)節(jié)作用可能與其可以減緩由于腦缺血損傷導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)和提高外周血血清中各種生長因子的含量有關(guān)。從而,在多因素的共同作用下,運動作用促進 EPCs的動員和歸巢。但運動訓(xùn)練的強度和內(nèi)容調(diào)節(jié)內(nèi)源性 EPCs的確切機制尚不明確,因此,還應(yīng)從這些方面進行深入的研究,為臨床康復(fù)訓(xùn)練治療腦梗塞奠定實驗基礎(chǔ)。

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Effect of Exercise Tra in ing on Cerebral Ischem ia-Reperfusion Injury of Endothelial Progen itor Cells

Zhao Ping et al
(Physical Education School,ChongqingUniversity,Chongqing 400044)

Objective:To study of the impact on the number of EPC in peripheral blood aftermovement training on middle cerebral artery occlusion(MCAO)and reperfusion model.Methods:Male SD rats with reference to Longa’s method improved the establishment ofMCAO models.TheMCAO mice were randomly divided into 4 groups①nor mal control group(synchronous breeding);② sham-operated control group;③operation control group;④operation+ exercise training group,all 18 mice in each group.Campaign Group:Treadmill Training for 2 weeks.MCAO, respectively,after 2d,6d,12d,the number of rat peripheral blood EPC changes.Results:After ischemia-reperfusion injury,surgical control rats significantly increased the number of peripheral blood EPCs with 2d as the peak,6d,12d somewhat lower than the 2d and 6d and 12d witnessed no significant statistical difference;while in the surgery+ exercise group,the number of EPCs in peripheral blood of several time point showed the tendecy of first rising followed by falling,the number of 2d showed no difference with the nor mal group,while the marked increase appeared in the number of 6d,which was higher than the other groups,but dropped in the number of 12d.Conclusion:The exercise training can increase the EPC in peripheral blood cells in rats afterMCAO and the number of sports can stimulate EPC mobilization and homing;,thereby to slow down the har m caused by cerebral ischemia.

exercise training,cerebral ischemia,endothelial progenitor cells,blood vessels renewal

Document code:A

1001—9154(2010)07—00

book=67,ebook=127

G804.2

A

1001—9154(2010)07—0067—05

國家自然科學(xué)基金(10872224);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費資助(項目編號:CDJSK100092)。

趙平(1974-),男,重慶人,講師,研究方向為運動人體科學(xué)。

2010—06—09