陳久艷 顧炳仁

精氨酸為氨基酸類藥，現(xiàn)行藥品標(biāo)準(zhǔn)采用家兔熱原法控制其質(zhì)量［1］，目前尚未見其細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的報(bào)道。鑒于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法具有靈敏快速、簡便易行、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，為擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，我們對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法應(yīng)用于精氨酸的質(zhì)控進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，以探討細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法取代兔熱原檢查法用于精氨酸產(chǎn)品質(zhì)量控制的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥與試劑 精氨酸:白色粉末，規(guī)格:原料藥，批號(hào):09021004、09021005、09021006，由蘇州東瑞制藥有限公司提供。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品:批號(hào):150601-200861，效價(jià):150 EU·支，由中國藥品生物制品檢定所提供。鱟試劑:批號(hào):0807260，靈敏度:0.125 EU/ml，由湛江博康海洋生物有限公司生產(chǎn);批號(hào):0903311，靈敏度:0.125 EU/ml，由湛江安度斯生物有限公司生產(chǎn)，試驗(yàn)前2批鱟試劑的靈敏度復(fù)核均符合規(guī)定。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用稀釋劑II(調(diào)節(jié)供試品的堿性，以下簡稱稀釋劑II):批號(hào):0903160，規(guī)格:4 ml/支，內(nèi)毒素含量小于0.003 EU/ml，由湛江安度斯生物有限公司提供。

1.2 儀器 ZH-2型自動(dòng)漩渦混合器，由天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠生產(chǎn);DC-3A型細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干式恒溫器，由南京三愛斯技術(shù)開發(fā)有限公司生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 精氨酸中細(xì)菌內(nèi)毒素限值的計(jì)算 按《中國藥典2005年版》［2］規(guī)定，細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)由公式 L=K/M計(jì)算。其中，K為人每公斤體重每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K值為5 EU/(kg·h);M為人每公斤體重每小時(shí)的最大給藥劑量，精氨酸為原料藥，根據(jù)其制劑鹽酸精氨酸注射液臨床使用最大劑量換算得到，M值為83 mg/(kg·h)。據(jù)此計(jì)算，精氨酸的L值為0.06 EU/mg，精氨酸是原料藥，考慮之后還有一個(gè)制劑生產(chǎn)過程，所以慎重起見，我們最后確定精氨酸的L值為0.01 EU/mg。

2.2 精氨酸稀釋度的確定 計(jì)算供試品最小有效稀釋濃度的公式為C=λ/L(L值為0.01 EU/mg，λ為鱟試劑的標(biāo)示靈敏度)，當(dāng) λ 分別為 0.5 EU/ml、0.25 EU/ml、0.125 EU/ml、0.062 EU/ml、0.031 EU/ml時(shí)，則供試品的最小有效稀釋濃度 C 應(yīng)分別為 50 mg/ml、25 mg/ml、12.5 mg/ml、6.2 mg/ml、3.1 mg/ml。

表1 精氨酸最高無干擾濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可見，當(dāng)供試品溶液濃度≤12.5 mg/ml時(shí)，對(duì)兩個(gè)廠家的鱟試劑不產(chǎn)生干擾作用，也就是對(duì)λ=0.125 EU/ml以上靈敏度的鱟試劑無干擾。

2.3 干擾試驗(yàn)

2.3.1 干擾試驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn) 試驗(yàn)前驗(yàn)證供試品熱原試驗(yàn)均符合規(guī)定。為排除供試品溶液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾，求出最高無干擾濃度，先進(jìn)行干擾試驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)。將3批精氨酸分別用稀釋劑 II配制成 50 mg/ml、25 mg/ml、12.5 mg/ml、6.2 mg/ml、3.1 mg/ml 5個(gè)不同濃度的供試品溶液(NPC)，并配制此系列濃度中含2λ的供試品陽性液(PPC)。選擇兩個(gè)廠家的λ為0.125 EU/ml的鱟試劑，分別加入0.1 ml稀釋劑II溶解，再分別加入0.1 ml不同濃度的NPC和PPC，混勻后，于37℃保溫60 min，同時(shí)作陽性對(duì)照(PC)和陰性對(duì)照(NC)，試驗(yàn)重復(fù)2管，結(jié)果見表1。

2.3.2 干擾確證試驗(yàn) 為進(jìn)一步確證供試品溶液對(duì)λ為0.125 EU/ml的鱟試劑是否存在干擾作用，用稀釋劑II和濃度為0.25 mg/ml的3個(gè)批號(hào)供試品溶液分別將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品配制成 0.250、0.125、0.062、0.031 EU/ml4 個(gè)濃度的系列內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。再分別用兩個(gè)廠家的λ為0.125 EU/ml的鱟試劑實(shí)驗(yàn)，同時(shí)做供試品溶液的對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)4管，結(jié)果見表2。

由表2可見，內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的Es值在0.5～2.0λ(包括0.5λ和2λ)范圍內(nèi)，而供試品的Et值則在0.5～2.0 Es(包括0.5Es和2.0 Es)范圍內(nèi)，確證濃度為12.5 mg/ml的3個(gè)供試品溶液對(duì)λ為0.125 EU/ml鱟試劑無干擾作用。

表2 精氨酸干擾確證試驗(yàn)結(jié)果

2.4 精氨酸的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 取3個(gè)批號(hào)的精氨酸，分別用稀釋劑II配制成濃度為12.5 mg/ml的供試品溶液，然后用兩個(gè)廠家的λ為0.125 EU/ml鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并設(shè)供試品陽性(2λ)、PC及NC，結(jié)果見表3。

表3 精氨酸的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)結(jié)果

由表3可見，3批精氨酸細(xì)菌內(nèi)毒素檢查均符合規(guī)定。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了精氨酸是否對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素的凝聚反應(yīng)有干擾作用，結(jié)果證明將精氨酸按《中國藥典》2005年版(二部)附錄Ⅺ E中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法試驗(yàn)，對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素凝聚反應(yīng)沒有干擾，使用λ為0.125 EU/ml的鱟試劑進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是可行的，確證了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法完全可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的兔熱原法用于該制劑的質(zhì)量控制。據(jù)此，提出精氨酸的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查參考標(biāo)準(zhǔn):取本品，以能夠調(diào)節(jié)本品的pH值的緩沖液稀釋，依照《中國藥典》2005年版(二部)附錄ⅪE檢查，每1 mg精氨酸中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.01 EU。

［1］國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典(二部).化學(xué)工業(yè)出版社，2005:831.

［2］國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典(二部).化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄85.