王維庭 房娟娟 閆濱

清熱化毒丸由連翹、青黛、黃連、大黃、菊花等15味藥物組成，具有清火化毒，消腫止痛的作用。用于小兒身熱煩躁，咽喉腫痛，口舌生瘡，皮膚瘡癤口臭便秘，疹后余毒未盡等癥狀。鹽酸小糪堿是清熱化毒丸中主要活性成分之一，以抗菌消炎為主。

近年來(lái)分析小檗堿型生物堿的方法分別有反向高效液相色譜法［1］，離子交換色譜法［2］，膠束色譜法［3］，薄層色譜-熒光分光光度法等。但此樣品成分復(fù)雜，且鹽酸小檗堿為季胺類(lèi)生物堿，堿性強(qiáng)，極性大，往往被色譜柱吸附，影響峰形，對(duì)色譜柱造成很大污染，高效毛細(xì)管電泳(HPCE)以其高效靈敏、分離速度快、樣品量小、消耗僅微量等優(yōu)點(diǎn)已越來(lái)越多的用于中藥成分分析及測(cè)定中。本文通過(guò)對(duì)清熱化毒丸中鹽酸小糪堿的毛細(xì)管電泳條件進(jìn)行摸索，建立了鹽酸小糪堿含量測(cè)定的高效毛細(xì)管電泳方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Beckman P/ACE 5500型高效毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)Beckman公司)，配備UV檢測(cè)器，Chemical Station工作站;酸度計(jì)Model PHS-2CA(上海大中分析儀器廠);超聲清洗器KQ-500E(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);萬(wàn)分之一電子天平(METTLER-TOLEDO中國(guó));涂層熔融石英毛細(xì)管柱(47 cm×75 m，河北永年光導(dǎo)纖維廠)。

1.2 試劑 鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào):110713-200609)購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所;甲醇為色譜純(天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)，水為自制重蒸餾水，其他試劑均為分析純。所需清熱化毒丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號(hào):9013395)，購(gòu)自藥店。

2 含量測(cè)定

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成1 mg/ml的對(duì)照品溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 供試品溶液的制備 取清熱化毒丸2丸，剪碎，稱(chēng)取3.0065 g置于100 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱(chēng)重后超聲(功率250 W，頻率30 kHz)處理30 min，放冷，稱(chēng)定重量，必要時(shí)用甲醇補(bǔ)足失重，過(guò)濾。濾液自然揮干后用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml容量瓶中，加入2 ml緩沖液后用甲醇定容，最后用0.45 μm有機(jī)膜過(guò)濾備用。

2.2 電泳條件 涂層熔融石英毛細(xì)管柱(47 cm×75 m，有效長(zhǎng)度為40 cm);檢測(cè)波長(zhǎng)為200nm，進(jìn)樣:氮?dú)鈮毫?586 KPa)自動(dòng)進(jìn)樣5 s，分離電壓為30KV，柱溫25℃，緩沖液體系為60 mmol/L磷酸緩沖溶液-甲醇(65:35)，調(diào)節(jié) pH值為3.2。

2.3 線性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量分別于10 ml容量瓶中，加入2 ml緩沖溶液，用甲醇定容至刻度得 0.05，006，0.07，008，0.09，0.10 mg/ml的對(duì)照品溶液，依次進(jìn)樣，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)對(duì)峰面積做回歸分析，得回歸方程為Y=1000000x-8143.9，r=0.9993。結(jié)果表明鹽酸小檗堿在0.05～0.10 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，(對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1)。

圖1 鹽酸小糪堿毛細(xì)管電泳色譜圖

2.4 精密度試驗(yàn) 取0.1 mg/ml鹽酸小糪堿對(duì)照品溶液，在上述電泳條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，以峰面積計(jì)算RSD為0.50%，表明在此條件下精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液一份，分別于0，2，4，8，10 h測(cè)定樣品的峰面積，求得RSD值為1.29%，實(shí)驗(yàn)表明供試品在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率測(cè)定 取5份已知含量的供試品溶液，加入適量對(duì)照品，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備，通過(guò)HPCE進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 清熱化毒丸中鹽酸小糪堿加樣回收率(g，mg，%)

2.7 樣品含量測(cè)定 按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液3份，在上述電泳條件下，每份進(jìn)樣兩次取平均值，得鹽酸小檗堿的含量測(cè)定結(jié)果為0.1357 mg/g(樣品色譜圖見(jiàn)圖2)。

圖2 清熱化毒丸中鹽酸小糪堿毛細(xì)管電泳色譜圖

3 討論

3.1 緩沖溶液的選擇 由于鹽酸小檗堿為季胺類(lèi)生物堿，帶有正電荷，用磷酸氫二鈉做為緩沖液可使其保持帶有正電荷，不同的緩沖液及不同的比例會(huì)影響成分之間的分離度。本實(shí)驗(yàn)先后在硼砂-甲醇及磷酸二氫鈉-甲醇不同濃度緩沖體系下進(jìn)行電泳分離，發(fā)現(xiàn)60 mmol/L磷酸二氫鈉-甲醇(65:35)的緩沖體系分離度較高，可達(dá)到良好的分離效果。

3.2 pH值的選擇 在毛細(xì)管電泳中，電滲流對(duì)pH值有較強(qiáng)的依賴(lài)性，直接影響待測(cè)成分的出峰時(shí)間，pH值降低，緩沖液呈酸性時(shí)，電滲流減弱，成分出峰時(shí)間延后，pH值升高，緩沖液偏堿性時(shí)，電滲流增強(qiáng)，成分出峰時(shí)間提前。并且離子的電泳淌度跟有效電荷成正比，極易受緩沖溶液pH值影響，因此緩沖溶液的pH值調(diào)節(jié)與控制是優(yōu)化分離的重要對(duì)策。同時(shí)緩沖溶液的pH值也會(huì)影響離子的有效電荷，從而間接影響分離效果。在硼砂-甲醇(85:15)緩沖體系(pH=9.0)中，樣品的出峰時(shí)間短，但未能達(dá)到基線分離。本實(shí)驗(yàn)又分別考察了磷酸二氫鈉緩沖體系(pH值分別為3.0、4.0、5.0)對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明，pH值為3.0時(shí)有良好的分離效果。

3.3 分離電壓的選擇 本試驗(yàn)考察了電壓為15 KV～30 KV時(shí)的影響。結(jié)果表明:電壓低時(shí)，基線穩(wěn)定，但樣品的分析時(shí)間延長(zhǎng)，峰形變寬;隨著電壓的增加，樣品的遷移時(shí)間縮短，峰型窄，分離效果好，但基線噪音有所增大?；趯?duì)遷移時(shí)間和基線的綜合考慮，本試驗(yàn)最終選用30 KV作為分離電壓。

3.4 毛細(xì)管有效柱長(zhǎng)的選擇 熔融石英毛細(xì)管柱長(zhǎng)是改變出峰時(shí)間的主要因素之一，一般目標(biāo)成分的出峰時(shí)間控制在15 min以?xún)?nèi)為宜。本實(shí)驗(yàn)考察了有效長(zhǎng)度為40 cm、50 cm、60 cm的毛細(xì)管對(duì)出峰時(shí)間的影響，結(jié)果表明，三者對(duì)于目標(biāo)組分均有良好的色譜峰形和分離度，但40 cm柱長(zhǎng)出峰時(shí)間在5 min左右，較為快速，因此優(yōu)先選擇40 cm柱長(zhǎng)毛細(xì)管。

綜上所述，在目前分析黃連藥材及其復(fù)方制劑的較常用的含量測(cè)定方法中，高效液相色譜法應(yīng)用最為廣泛，薄層層析方法已經(jīng)較為少見(jiàn)。高效液相色譜法分離具有重現(xiàn)性好，分離效果穩(wěn)定、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但是由于小糪堿是季胺堿，堿性強(qiáng)，極性強(qiáng)，易離子化，且易使液相色譜柱中的ODS染色，需要大量溶劑沖洗且耗時(shí)較多，而且由于黃連中含多種季胺堿，極性類(lèi)似，液相色譜不易將其分開(kāi)，相互之間易造成干擾。HPCE的區(qū)帶電泳模式，由于使用熔融石英毛細(xì)管空管，不怕污染和堵塞，易清洗，且有分離效率高，樣品需要量極少的特點(diǎn)，僅使用簡(jiǎn)單少量的緩沖液，幾乎不產(chǎn)生廢液，分析耗費(fèi)低，樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，幾乎可稱(chēng)為綠色分析方法，尤其適合于基質(zhì)比較復(fù)雜，結(jié)構(gòu)近似的藥用植物成分的分析。在本實(shí)驗(yàn)中，可同時(shí)分離黃連中的7個(gè)季胺生物堿，專(zhuān)屬性和分離度良好，可用于該類(lèi)成分的指紋圖譜研究。HPCE既可結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)建立復(fù)方藥物指紋圖譜，又可進(jìn)行多種有效成分或指標(biāo)成分定量，還可用于體內(nèi)藥物分析，開(kāi)展有效成分研究。HPCE分離分析藥用植物成分的發(fā)展具有極為廣闊的前景。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)．北京:化學(xué)工版社，2005:705．

［2］文欣欣，劉丹華，余陳歡，等．薄層色譜-熒光分光光度法測(cè)定黃連及香連丸中鹽酸小檗堿的含量．中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2008，15(10):54．

［3］余為，胡薏冰．高效毛細(xì)管電泳法測(cè)定紫黃止血消炎粉中鹽酸小檗堿的含量．中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2008，3(15):73．