李 琳 袁 斌 于希忠 徐建亞 趙長(zhǎng)江 吳琴琴

清肺口服液對(duì)呼吸道合胞病毒感染人胚肺成纖維細(xì)胞TGF－β1mRNA基因表達(dá)的影響＊

李 琳1袁 斌2△于希忠3徐建亞1趙長(zhǎng)江4吳琴琴1

目的探討清肺口服液含藥血清對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)感染的人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β1(TGF－β1)基因表達(dá)的影響。方法RSV攻擊體外培養(yǎng)的HELF細(xì)胞后，以清肺口服液含藥血清、利巴韋林含藥血清及空白血清干預(yù)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定各組HELF TGF－β1表達(dá)變化。結(jié)果 病毒對(duì)照組較正常細(xì)胞組TGF－β1下降至1/3，清肺口服液含藥血清組可顯著升高TGF－β1水平至RSV感染細(xì)胞的2倍。利巴韋林含藥血清和空白血清作用相似，對(duì)TGF－β1表達(dá)有一定的影響。結(jié)論RSV感染可使HELF細(xì)胞TGF－β1mRNA表達(dá)水平顯著下降;清肺口服液可調(diào)節(jié)TGF－β1mRNA表達(dá)，減緩RSV感染后細(xì)胞的異常變化，這可能是其抗病毒作用機(jī)制之一。

清肺口服液 呼吸道合胞病毒 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1南京中醫(yī)藥大學(xué)(南京210029)

2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(南京210029)

3南京師范大學(xué)(南京210097)

4江蘇省江陰市人民醫(yī)院(江陰214400)

＊江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.BK2005219);江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(No.2008022D)

△通信作者

肺炎是兒科臨床常見病、多發(fā)病，據(jù)報(bào)道，全世界5歲以下兒童每年200～300萬(wàn)死于肺炎。我國(guó)每年死于肺炎的小兒約30～40萬(wàn)，本病己成為我國(guó)小兒發(fā)病的第1位病因及第1位死因[1]。呼吸道合胞病毒(RSV)是世界范圍內(nèi)小兒呼吸道感染最重要的病毒病原，引起的肺炎癥狀較重，嚴(yán)重影響小兒的生命健康。RSV感染后主要表現(xiàn)為毛細(xì)支氣管炎，血管炎和間質(zhì)性肺炎。相關(guān)發(fā)病學(xué)機(jī)制研究表明，多種生長(zhǎng)因子同時(shí)參與肺的炎癥反應(yīng)，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF－β1)對(duì)調(diào)控肺成纖維細(xì)胞分裂、增殖及膠原蛋白的合成與降解起十分重要的作用[2]。我們前期臨床研究表明清肺口服液對(duì)RSV肺炎具有較好的療效[3]，而體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，清肺口服液對(duì)感染RSV后人胚肺成纖維(HELF)細(xì)胞TGF－β1蛋白水平的降低，具有一定的調(diào)節(jié)作用。為進(jìn)一步探討TGF－β1在本病發(fā)病中的作用，闡明清肺口服液的療效機(jī)理，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Real Time－PCR)，從基因水平觀察了各組RSV感染后人胚肺成纖維細(xì)胞TGF－β1mRNA表達(dá)變化。

1 材料

1.1 動(dòng)物及試劑 健康大耳白兔9只，雌雄各半，體質(zhì)量2.5～3kg，由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào):SCXK(蘇)2005－0009。DMEM 培養(yǎng)基(美國(guó) Gibico公司)，新生牛血清 (杭州四季青公司)，胰蛋白酶 (美國(guó)Gibico公司)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào):1392923)，M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó) Promega);SYRB Green I(美國(guó) Stratagene); 人 TGF－β1、β－actin引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 細(xì)胞及病毒株 HELF、人喉癌上皮細(xì)胞Hep－2均由凱基生物科技發(fā)展有限公司提供，本實(shí)驗(yàn)采用第5～30代細(xì)胞。呼吸道合胞病毒A亞型Long株，由廣州博特生物工程有限責(zé)任公司提供，在人喉癌上皮細(xì)胞(Hep－2)上增殖活化。

1.3 藥品制備 清肺口服液:主要藥物為麻黃、葶藶子、虎杖等，由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室負(fù)責(zé)制劑和質(zhì)量控制，每劑含生藥1mg/mL。利巴韋林顆粒(新博林):四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)080335。含藥血清及空白血清的制備:將動(dòng)物隨機(jī)分為3組;A組灌服清肺口服液，給藥劑量48g/(kg·d)，分兩次給予(相當(dāng)于臨床等效劑量的4倍);B組灌服利巴韋林溶液，劑量31mg/(kg·d);C組給相應(yīng)體積的生理鹽水。連續(xù)給藥3d，末次給藥前12h禁食不禁水。末次給藥1h后，頸動(dòng)脈分離取血，血液靜置30min后，離心取血清，56℃水浴30min滅活，在超凈工作臺(tái)上過(guò)濾除菌，分裝于1.5mL EP管，－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 儀器 MCO－20AIC CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)，MDF－382超低溫冰箱(日本SANYO)，IX50型倒置顯微鏡(日本Olympus)，5417型低溫高速離心機(jī)、Biophometer生物分光光度計(jì)(德國(guó)EPPENDORF)，Mx3000P熒光定量PCR儀(美國(guó)Stratagene)。

2 方法

2.1 人喉癌上皮細(xì)胞的培養(yǎng) Hep－2置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)液可選用DMEM加10%新生牛血清，生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞每2～3天可傳代，0.25%胰酶消化，常溫下約需2min，以鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓時(shí)停止消化，每次分3～4瓶。

2.2 病毒的擴(kuò)增 待Hep－2在25mL培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)滿60% ～70%后，倒去液體，加入適量(300～500μL)病毒液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1.5h后，補(bǔ)充維持液(DMEM培養(yǎng)液含2%新生牛血清)3mL。逐日觀察細(xì)胞病變(CPE，典型病變是融合的大泡)，病變達(dá)75%以上時(shí)收集病毒液，2000r/min離心8min，分裝，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 含藥血清和含利巴韋林血清對(duì)Hep－2細(xì)胞最大無(wú)毒濃度測(cè)定 將1×105/mL濃度的HELF細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞板，每孔0.1mL，培養(yǎng)24h。以DMEM單培稀釋清肺口服液含藥血清、利巴韋林含藥血清及空白血清，依次設(shè)50%、40%、30%、20%、10%5個(gè)濃度。將長(zhǎng)成單層細(xì)胞的細(xì)胞板棄去培養(yǎng)液，分別加入各濃度的含藥血清及空白血清，每孔0.1mL，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察5d。細(xì)胞無(wú)病變的最低稀釋度為最大無(wú)毒濃度。結(jié)果為20%含藥血清。

2.4 RSV組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(TCID50)測(cè)定 以1×105/mL濃度的Hep－2細(xì)胞接種96孔細(xì)胞板，每孔0.1mL。病毒懸液用DMEM單培10倍梯度稀釋8個(gè)濃度。在接種細(xì)胞后18～36h內(nèi)，細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)吸棄培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞面，接種各稀釋度的病毒液，每個(gè)稀釋度接種5孔，每孔50μL，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中吸附1.5h。吸棄病毒液，每孔加入2%維持液100μL，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察病變。以最高稀釋度不再出現(xiàn)新病變時(shí)為終點(diǎn)，計(jì)算TCID50，結(jié)果RSV TCID50為 10－3.34/100μL，TCID50≥50% 的陽(yáng)性百分率稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比率。

2.5 HELF細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將復(fù)蘇后的HELF細(xì)胞以1×106/瓶接種于25mL培養(yǎng)瓶中，加入DMEM全培(含10%新生牛血清)，置37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿瓶壁后，用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。隨著細(xì)胞數(shù)量的增多，分5組:含藥血清組、空白血清組、利巴韋林血清組、病毒對(duì)照組、正常細(xì)胞組。每組兩瓶細(xì)胞。

2.6 病毒攻擊及細(xì)胞收獲 培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層(密度約90%以上)時(shí)，除正常細(xì)胞組外，各組細(xì)胞均棄上清液，用DMEM單培漂洗1遍后，加入100μL 100TCID50病毒液與100μL單培，置CO2培養(yǎng)箱吸附1.5h。后棄去病毒液，DMEM單培漂洗2次，分別加入20%清肺口服液含藥血清，20%空白血清，20%利巴韋林含藥血清;正常細(xì)胞組和病毒對(duì)照組只加維持液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。棄去各組上清液，PBS漂洗1遍，加入1mL單培，以細(xì)胞刮刀輕刮細(xì)胞至培養(yǎng)液中，2000r/min離心10min，收集細(xì)胞沉淀于1.5mL dorf管中。

2.7 細(xì)胞總RNA的提取 每組細(xì)胞沉淀中加入1mL Tizol，輕輕吹打，裂解細(xì)胞。4℃，12000r/min離心10min，收集上清液，轉(zhuǎn)移到新的無(wú)RNA酶的1.5mL dorf管中。常溫放置5min后，每1毫升Trizol加氯仿200μL，劇烈震蕩至呈粉紅色。常溫放置2～3min后，4℃，12000r/min離心15min。去上清，每1毫升Trizol加500μL異丙醇，輕搖晃均勻。常溫放置10min后4℃，15000r/min離心，16min。棄上清液，加入75%的乙醇(Rnase－free水配制)，4℃，12000r/min 離心。10min，沉淀?？馗梢掖迹琑NA 沉淀干燥5～10min后加Rnase－free水溶解，于Biophometer生物分光光度計(jì)上測(cè)定各組RNA純度及濃度，其中A260/A280＞1.7，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.8 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 5μL Rnase－free水，加1μL隨機(jī)引物，2μg RNA，70℃，5min混合，再置冰上速凍5min。然后依次加入5μL Buffer、0.625μL RNase抑制劑、1.25μL dNTP，加入補(bǔ)齊反應(yīng)體系(25μL)所需相應(yīng)量水，最后加1μL逆轉(zhuǎn)錄酶M－MLV。42℃逆轉(zhuǎn)錄1h，冰浴5min，合成cDNA第1鏈，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.9 Real Time PCR擴(kuò)增β－actin、TGF－β1基因片斷 引物的設(shè)計(jì):在GenBank中進(jìn)行搜索，獲得所需序列，根據(jù)序列的5'末端與3'末端設(shè)計(jì)引物。TGF－β1－F:5'－TGG AAA CCC ACA ACG AAA T－3'，TGF－β1－R:5'－AGG CG AAA GCC CTC AAT－3'，退火溫度為52℃。β－actin－F:5'－GTG CGG AAG CCA ATC－3'，β－actin－R:5'－ACG GAC GAG GGA AAC AAT －3'。

各取上述cDNA產(chǎn)物1μL做模板，利用SYBR Green I染料實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)藥物處理后RSV感染的HELF細(xì)胞TGF－β1 mRNA表達(dá)變化，以β－actin作為內(nèi)對(duì)照。實(shí)時(shí)Real Time－PCR反應(yīng)體系:7.5μL 2×Mix(含熒光染料 SYRB，dNTP 等)、上下游引物各 3μL、cDNA 1μL。擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性 10min，95℃30s，52℃退火60s，72℃延伸30s，于 Mx3000P熒光定量 PCR儀內(nèi)擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)(見圖1)。每份標(biāo)本設(shè)2個(gè)復(fù)孔檢測(cè)，取其循環(huán)閾值均值(Ct值，即PCR反應(yīng)過(guò)程中出現(xiàn)熒光信號(hào)的初始循環(huán)數(shù))。采用比較2－△△Ct法分析各基因在細(xì)胞中的相對(duì)含量?！鳌鰿t=(Ct目的基因－Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組－(Ct目的基因－Ct管家基因)對(duì)照組，以△△Ct值為定量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，則目的基因的量 =2－△△Ct[8]。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞總RNA質(zhì)量及純度檢驗(yàn) 每份樣品其A260nm/A280nm吸光度比值均在1.8～2.0之間，說(shuō)明所提RNA純度較高。

3.2 藥物處理后RSV感染的HELF細(xì)胞TGF－β1的mRNA表達(dá)變化 見表1，圖1。結(jié)果顯示，與正常細(xì)胞比較，病毒感染24h后，HELF細(xì)胞中TGF－β1的表達(dá)量下降為1/3;而感染病毒后馬上用空白血清或含利巴韋林的血清干預(yù)，HELF細(xì)胞中TGF－β1的表達(dá)量回復(fù)上升為病毒對(duì)照組的3倍多，甚至比正常細(xì)胞組還高;與空白血清組或含利巴韋林組不同，感染病毒后馬上用含清肺口服液的血清干預(yù)，HELF細(xì)胞中TGF－β1的表達(dá)量回復(fù)上升為病毒對(duì)照組的近2倍，但仍然比正常細(xì)胞組稍低。

表1 各組細(xì)胞熒光定量Ct值及2－△△Ct值

圖1 TGF－β1擴(kuò)增曲線

4 討論

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的Real Time－PCR技術(shù)以其靈敏度高、檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已在病原體定性定量檢測(cè)、腫瘤基因檢測(cè)、免疫分析、基因表達(dá)水平分析及其多態(tài)性研究等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用[4－5]。在RSV感染的過(guò)程中，RSV感染激發(fā)了機(jī)體的免疫系統(tǒng)，諸多細(xì)胞因子參與了此過(guò)程。在肺纖維化病灶區(qū)，TGF－β1作為細(xì)胞因子之一，作用于多個(gè)環(huán)節(jié)，在炎性細(xì)胞和非炎性細(xì)胞以及肺間質(zhì)中表達(dá)增加，且其在炎性細(xì)胞內(nèi)的增加出現(xiàn)較早。TGF－β1在肺間質(zhì)纖維化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其過(guò)度表達(dá)，將加重炎癥反應(yīng)與細(xì)胞過(guò)度增殖及各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放，促進(jìn)肺泡炎及肺纖維化形成。研究證實(shí)TGF－β1 mRNA的高度表達(dá)可激發(fā)肺泡炎癥，在肺泡急性炎癥及間質(zhì)性肺炎中發(fā)揮重要作用[6]。我們前期研究表明，體外培養(yǎng)的人胚肺成纖維細(xì)胞感染RSV后，經(jīng)ELISA法檢測(cè)其細(xì)胞上清液中TGF－β1較正常組明顯降低。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)RSV感染可使TGF－β1mRNA表達(dá)降低，說(shuō)明病毒感染不僅可從蛋白質(zhì)水平，尚可從mRNA水平調(diào)節(jié)TGF－β1的表達(dá)，TGF－β1可能參與了RSV肺炎的發(fā)病過(guò)程。

利用RSV攻擊體外培養(yǎng)的HELF細(xì)胞后，以清肺口服液含藥血清、利巴韋林含藥血清及空白血清干預(yù)，采用Real Time－PCR法測(cè)定各組人胚肺成纖維細(xì)胞TGF－β1mRNA表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病毒對(duì)照組較正常細(xì)胞組TGF－β1下降為1/3，提示可能在病毒感染的早期TGF－β1的產(chǎn)生被抑制，不能發(fā)揮抗過(guò)度免疫反應(yīng)的作用。經(jīng)清肺口服液含藥血清組可顯著升高TGF－β1至RSV感染細(xì)胞的2倍，提示清肺口服液可以拮抗這種異常變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)清肺口服液含藥血清作用后，過(guò)度降低的TGF－β1水平又回復(fù)升高。清肺口服液可調(diào)節(jié)TGF－β1等細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)，緩減RSV感染后細(xì)胞的異常變化，這可能是其抗病毒作用的機(jī)制之一。利巴韋林含藥血清和空白血清作用相似，對(duì)TGF－β1表達(dá)有一定的影響?？瞻籽遄饔煤?，TGF－β1水平過(guò)度表達(dá)，提示血清中可能含有某些物質(zhì)能夠促進(jìn)TGF－β1的轉(zhuǎn)錄從而激發(fā)肺泡炎癥，而清肺口服液使病毒感染細(xì)胞的TGF－β1回復(fù)上升的同時(shí)可以拮抗血清誘導(dǎo)的TGF－β1的過(guò)度表達(dá)，從而使其達(dá)到適中水平。利巴韋林含藥血清與空白血清作用相似，沒(méi)有顯示藥物作用，進(jìn)一步佐證了利巴韋林抗病毒作用靶點(diǎn)不在TGF－β1上。

綜上所述，RSV的致病過(guò)程中可能有細(xì)胞因子TGF－β1的參與。清肺口服液可以通過(guò)對(duì)TGF－β1mRNA的影響，從基因水平對(duì)炎癥細(xì)胞因子加以干預(yù)，阻斷病毒性肺炎發(fā)病過(guò)程，這可能是其抗病毒作用機(jī)制之一，但是病毒性肺炎的發(fā)病機(jī)理是復(fù)雜的，是多種細(xì)胞因子參與、共同作用的結(jié)果，TGF－β1在其中究竟通過(guò)何種途徑起作用尚需要更多的實(shí)驗(yàn)加以闡明。本實(shí)驗(yàn)從基因水平探討清肺口服液的藥物動(dòng)力學(xué)，為進(jìn)一步探討清肺口服液抗病毒機(jī)制提供依據(jù)和支持。此外，實(shí)驗(yàn)研究中建立的藥物對(duì)RSV相關(guān)基因調(diào)控影響的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用，可為病毒性疾病實(shí)驗(yàn)研究提供參照。

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Effect of Qingfei Oral Liquid on TGF-β1mRNA expression of Respiratory Syncytial Virus Infected Human Embryonic Lung Fibroblasts

LI Lin1，YUAN Bin2，YU Xi-zhong3， et al
1 Nanjing University of Chinese Medicine(Nanjing 210029)
2 Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine(Nanjing 210029)
3 Nanjing Normal University(Nanjing 210097)

Objective:To study the effect of Qingfei Oral Liquid on expression of TGF－β1geng in Respiratory Syncytial Virus(RSV)infected Human Embryonic Lung Fibroblasts(HELF).MethodsHELF cells in vitro cultured infected with RSV were intervened by the Qingfei Oral Liquid medicated serum，the ribavirin medicated serum and the blank serum.The expression variation of the TGF－β1in the HELF was detected by the Real－time fluorescence quantitative PCR method.ResultsCompared with normal cell，TGF－β1with virus infection was decreased to 1/3.The TGF－β1in the Qingfei Oral Liquid medicated serum group was increased to 2 times of that in RSV infected cells.Ribavirin medicated serum group and blank serum group have similar effect.They have certain effect on expression of TGF－β1.ConclusionThe expression level of TGF－β1mRNA in HELF cells infected with RSV could be decrease significantly.Qingfei Oral Liquid can regulate mRNA expression of TGF－β1and attenuate the abnormal changes of RSV infected cells.It may be one of the mechanisms of its antiviral effect.

Qingfei Oral Liquid;Respiratory Syncytial Virus;Transforming growth factor(TGF) －β1;Real－time fluorescence quantitative PCR method

R285.5

A

1004－745X(2010)10－1724－03

2010－01－11)