楊 宇,徐仁芳,何小舟,徐海燕

(蘇州大學(xué)a.研究生院2008級;b.第三附屬醫(yī)院泌尿外科,江蘇常州213003)

微小RNA(miRNA)是一類分布廣泛的、大約22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼 RNA,通過控制靶miRNAs,達(dá)到調(diào)控靶基因的表達(dá)或翻譯。miRNAs在生物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著非常重要的調(diào)節(jié)作用,目前的研究證實腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與miRNAs之間存在著錯綜復(fù)雜的關(guān)系,大約有一半的 miRNAs其上游基因位于染色體中及腫瘤相關(guān)的區(qū)域內(nèi),而且多種腫瘤中均存在微小RNA(miRNA)異常表達(dá)[1]。提示miRNAs可以起到腫瘤抑制基因或者癌基因的功能,并且miRNAs與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷及預(yù)后判斷等方面均存在密切的聯(lián)系[2]。另外,在腎臟方面,敲除了腎小球足突細(xì)胞特異性的微小RNA(microRNA)合成關(guān)鍵酶的小鼠迅速出現(xiàn)大量蛋白尿,從而導(dǎo)致腎小球和腎小管嚴(yán)重的急性損傷,并很快因急性腎功能衰竭死亡[3],提示microRNA對于維持腎小球濾過屏障至關(guān)重要。本研究通過觀察miRNA-185在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá),旨在為探討miRNA-185及其他miRNA在腎癌中的生物學(xué)功能以及與腫瘤的關(guān)系提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2008年11月至2010年5月在蘇州大學(xué)第三附屬醫(yī)院泌尿外科進(jìn)行手術(shù)切除并保存于液氮中的腎癌組織標(biāo)本(腎癌組)22例,男13例,女9例,年齡35～78歲。術(shù)后病理診斷均為腎透明細(xì)胞癌。病理學(xué)分期:G1(高分化癌)4例,G2(中分化癌)12例,G3(低分化癌)6例。選擇同期肉眼觀癌旁正常組織(癌旁正常組織距離腫瘤邊緣＞5 cm)標(biāo)本(癌旁組)22例。

1.2 主要試劑與儀器

microRNA快速提取試劑盒(百泰克公司),miScript Reverse Transcription Kit、miScript SYBR?Green PCR Kit(德國QIAGEN公司),miS-cript Primer Assays(德國QIAGEN公司),常規(guī)試劑由常州市第一人民醫(yī)院泌尿外科實驗室提供。DU800紫外分光光度計(美國BECKMAN COULTER公司),ChemiDocTM XRS+電泳照膠儀(美國BIORAD公司),ABI 7500 Real-time PCR儀(美國ABI公司),EPPENDORF 5332型普通PCR儀(德國EPPENDORF公司),Himac CT15E低溫超速離心機(日本Hitachi公司)。

1.3 方法

1.3.1 2組組織標(biāo)本中miRNA的提取

使用microRNA快速提取試劑盒提取、純化2組組織標(biāo)本中的miRNA,后溶于無RNAase水中,DU800紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度,選取OD260/OD280吸光度比值＞1.8的樣本保存于-70℃低溫冰箱,詳細(xì)提取步驟可參閱產(chǎn)品說明書。

1.3.2 RT-PCR檢測2組組織中miRNA-185表達(dá)情況

將提取的miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。miRNA-185的序列從Sanger Institute的 miRBase:Sequence數(shù)據(jù)庫查得。其檢測步驟為:①在逆轉(zhuǎn)錄過程中,采用poly(A)聚合酶給miRNA添加多聚腺苷酸尾巴;②逆轉(zhuǎn)錄酶將miRNA和 RNA都轉(zhuǎn)化為cDNA;③PCR:oligo-dT引物在 5′末端帶有通用標(biāo)簽,與miScript Universal Primer特異性結(jié)合,并與miRNA-specific primer一起以此確保 PCR過程中miRNA的特異性擴增;④將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。本實驗采用 U6 RNA作為內(nèi)參照,根據(jù) miScript ReverseTranscription Kit說明書分別加入RT-PCR反應(yīng)所需試劑、引物、miRNA樣品等進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄條件:37℃60 min,95℃5 min。PCR條件:95℃15 min,94℃15 s,55℃30 s,70℃34 s;40個循環(huán)。PCR結(jié)果用4%瓊脂糖膠上樣電泳,電泳照膠儀下觀察。將逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板,進(jìn)行PCR擴增從而準(zhǔn)確驗證miRNA-185在2組組織中的表達(dá)情況。

1.3.3 Rea1-time PCR檢測2組組織中miRNA-185表達(dá)情況

采用SYBR Green熒光染料法,U6 RNA作為內(nèi)參照,循環(huán)閾值(Ct)比較法進(jìn)行miRNA表達(dá)相對定量分析,從而準(zhǔn)確驗證miRNA-185在2組組織中的表達(dá)情況[4]。以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,應(yīng)用 miScript Primer Assay配合 miScript SYBRGreen PCR Kit進(jìn)行Real-time PCR分析;應(yīng)用miScript Universal Primer和miRNA-specific primer(miScript Primer Assay)擴增miRNA。Real-time PCR條件:95℃15 min,94℃15 s,55℃30 s,70℃34 s;循環(huán)40次,30 L反應(yīng)體系。隨后繼續(xù)進(jìn)行建立熔解曲線的反應(yīng):95℃變性1 min;在55～95℃的區(qū)間內(nèi)進(jìn)行熔解實驗,即緩慢升溫,每個溫度1個循環(huán),每個循環(huán)30 s,共 40個循環(huán)。每管設(shè)3個復(fù)孔,冰上避光操作。反應(yīng)結(jié)束后,電腦自動得出熔解曲線,結(jié)果用ABI自帶軟件分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

目的基因相對表達(dá)量 =2-ΔΔCt,2-ΔΔCt表示的是腎癌組(作為實驗)目的基因表達(dá)相對于癌旁組(作為對照)變化的倍數(shù)。在目的基因與內(nèi)參基因擴增效率相同的情況下可以直接得到目的基因相對于內(nèi)參基因的定量[5]。ΔΔ Ct=(Ct目的-Ct內(nèi)參)實驗-(Ct目的-Ct內(nèi)參)對照,把所得到的CT值還原為目的基因的量,進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換后符合正態(tài)分布的規(guī)律。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗;相關(guān)性分析采用Pearson法,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

1) RT-PCR電泳結(jié)果顯示,miRNA-185和U6 RNA均呈單一條帶,其所處的位置及其在正常組織和癌組織中的表達(dá)情況符合前期的預(yù)計(圖1),證明相應(yīng)的實驗條件和所設(shè)計的引物均符合實驗要求。

圖1 正常組織和腫瘤組織RT-PCR電泳圖

2) Real-time PCR結(jié)果顯示,Real-time PCR根據(jù)所得的熔解曲線可知,miRNA-185及U6 RNA基因擴增產(chǎn)物的熔解曲線峰均為單一峰形,未見其他峰值,并且峰的形狀也較銳利,提示無引物二聚體的生成和干擾,獲得的PCR產(chǎn)物具有特異性,以此為基礎(chǔ)進(jìn)行定量是可靠的。Real-time PCR得到的ΔΔ Ct通過 2-ΔΔCt可求得目的基因相對表達(dá)量 ,結(jié)果顯示:miRNA-185在腎癌組組織中呈高表達(dá),較癌旁組織平均升高5.14倍。22例標(biāo)本中有17例(77%)腎癌組組織中 miRNA-185陽性表達(dá)率為77.3%(17/22),明顯高于癌旁組的22.7%(5/22)(P＜0.05)。腎癌標(biāo)本中miRNA-185的表達(dá)高于其在癌旁正常組織中的表達(dá),表達(dá)倍數(shù)最大值為29.14,最小值為0.06。

3) G1期的4例腎癌標(biāo)本均較相應(yīng)的癌旁正常組織呈現(xiàn)低表達(dá),高表達(dá)的則離散分布在G2和G3期。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,miRNA-185在腎透明細(xì)胞癌組織中的相對表達(dá)量與腎癌病理學(xué)分期呈正相關(guān)(r=0.58,P＜0.05)。

3 討論

microRNA是一類廣泛存在于動植物和人類體內(nèi)的非編碼小分子RNA。成熟的microRNA通常為22個左右的核糖核苷酸組成,在轉(zhuǎn)錄后水平通過降解目標(biāo)mRNA或抑制翻譯調(diào)節(jié)基因表達(dá),在調(diào)控基因表達(dá)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究表明,miRNAs在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中既可能起到扮演癌基因,也可扮演抑癌基因的角色[6-8],因此miRNA在惡性腫瘤的發(fā)病機制、早期診斷以及尋找新的治療手段的研究中有著重要的意義。

雖然已經(jīng)明確miRNAs對腫瘤發(fā)展過程中基因表達(dá)調(diào)控里有重要作用,但對于miRNA在腫瘤和正常組織中表達(dá)量的多少還不明確。既往主要采用液相雜交、Nothern blotting檢測miRNA,靈敏度不高,且miRNA前體和其基因組均可產(chǎn)生非特異性信號,導(dǎo)致特異性降低[9]。筆者通過poly(A)聚合酶給miRNA添加多聚腺苷酸尾巴,同時,逆轉(zhuǎn)錄酶將 miRNA和 RNA都轉(zhuǎn)化為 cDNA,并通過miScript UniversalPrimer與 miRNA-specific primer將其擴增出來,具有高度特異性、實驗設(shè)計簡單、成本低廉及通用性好等優(yōu)點,可用于檢測多種目的miRNA。另外,本實驗利用實時定量PCR技術(shù),選擇miRNA-185作為研究對象,分析22例腎透明細(xì)胞癌手術(shù)患者標(biāo)本中癌組織與癌旁正常組織中miRNA-185的表達(dá)情況,并對組織學(xué)分期進(jìn)行縱向比較,找出腫瘤各期miRNA-185的差異,其高表達(dá)提示miRNA-185在腎透明細(xì)胞癌中很可能具有癌基因作用。

microRNA的發(fā)現(xiàn)在2002年被《Science》雜志列為十大科技突破之首[10],而miRNAs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用研究是目前熱點。盡管已經(jīng)有很大進(jìn)步,但在miRNAs與腫瘤特別是泌尿系腫瘤方面之間還有很多問題值得進(jìn)一步的研究。因此尋找特定的microRNA作為泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷的指標(biāo)、治療的手段或靶點有可能成為從根本上防治這些疾病的一個新的突破口。

[1]Calin G A,Sevignani C,Dumitru C D,et al.Human miaroRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers[J].PNAS,2004,101(9):2999-3004.

[2]Medina P P,Slack F J.MicroRNAs and cancer:an overview[J].Cell Cy cle,2008,7(16):2485-2492.

[3]Ho J,Ng K H,Rosen S,et al.Podocyte-specific loss of functional microRNAs leads to rapid glomerular and tubular injury[J].J Am Soc Nephrol,2008,19(11):2069-2075.

[4]Schmittgen T D,Lee E J,Jiang J,et al.Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA[J].M ethods,2008,44(1):31-38.

[5]Yuan J S,Reed A,Chen F,et al.Statistical analy sis of real-time PCR data[J].BMC Bioinformatics,2006,7:85.

[6]Esquela Kerscher A,Slack F J.Oncomirs-microRNAs with a role in cancer[J].Nat Rev Cancer,2006,6(4):259-269.

[7]Hammond S M.MicroRNAs as oncogenes[J].Curt Opin Genet Dev,2006,16(1):4-9.

[8]Cho W C.OncomiRs:the discovery and progress of microRNAs in cancers[J].Mol Cancer,2007,6:60.

[9]Wang B,Doench J G,Novina C D.Analysis of microRNA effector functions in vitro[J].Methods,2007,43(2):91-104.

[10]Couzin J.Breakthrough of the y ear.Small RNAs make big splash[J].Science,2002,298(5602):2296-2297.