楊 宇,徐仁芳,何小舟,徐海燕

(蘇州大學(xué)a.研究生院2008級(jí);b.第三附屬醫(yī)院泌尿外科,江蘇常州213003)

微小RNA(miRNA)是一類(lèi)分布廣泛的、大約22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼 RNA,通過(guò)控制靶miRNAs,達(dá)到調(diào)控靶基因的表達(dá)或翻譯。miRNAs在生物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的調(diào)節(jié)作用,目前的研究證實(shí)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與miRNAs之間存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系,大約有一半的 miRNAs其上游基因位于染色體中及腫瘤相關(guān)的區(qū)域內(nèi),而且多種腫瘤中均存在微小RNA(miRNA)異常表達(dá)[1]。提示miRNAs可以起到腫瘤抑制基因或者癌基因的功能,并且miRNAs與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷及預(yù)后判斷等方面均存在密切的聯(lián)系[2]。另外,在腎臟方面,敲除了腎小球足突細(xì)胞特異性的微小RNA(microRNA)合成關(guān)鍵酶的小鼠迅速出現(xiàn)大量蛋白尿,從而導(dǎo)致腎小球和腎小管?chē)?yán)重的急性損傷,并很快因急性腎功能衰竭死亡[3],提示microRNA對(duì)于維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障至關(guān)重要。本研究通過(guò)觀(guān)察miRNA-185在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá),旨在為探討miRNA-185及其他miRNA在腎癌中的生物學(xué)功能以及與腫瘤的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2008年11月至2010年5月在蘇州大學(xué)第三附屬醫(yī)院泌尿外科進(jìn)行手術(shù)切除并保存于液氮中的腎癌組織標(biāo)本(腎癌組)22例,男13例,女9例,年齡35～78歲。術(shù)后病理診斷均為腎透明細(xì)胞癌。病理學(xué)分期:G1(高分化癌)4例,G2(中分化癌)12例,G3(低分化癌)6例。選擇同期肉眼觀(guān)癌旁正常組織(癌旁正常組織距離腫瘤邊緣＞5 cm)標(biāo)本(癌旁組)22例。

1.2 主要試劑與儀器

microRNA快速提取試劑盒(百泰克公司),miScript Reverse Transcription Kit、miScript SYBR?Green PCR Kit(德國(guó)QIAGEN公司),miS-cript Primer Assays(德國(guó)QIAGEN公司),常規(guī)試劑由常州市第一人民醫(yī)院泌尿外科實(shí)驗(yàn)室提供。DU800紫外分光光度計(jì)(美國(guó)BECKMAN COULTER公司),ChemiDocTM XRS+電泳照膠儀(美國(guó)BIORAD公司),ABI 7500 Real-time PCR儀(美國(guó)ABI公司),EPPENDORF 5332型普通PCR儀(德國(guó)EPPENDORF公司),Himac CT15E低溫超速離心機(jī)(日本Hitachi公司)。

1.3 方法

1.3.1 2組組織標(biāo)本中miRNA的提取

使用microRNA快速提取試劑盒提取、純化2組組織標(biāo)本中的miRNA,后溶于無(wú)RNAase水中,DU800紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度,選取OD260/OD280吸光度比值＞1.8的樣本保存于-70℃低溫冰箱,詳細(xì)提取步驟可參閱產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

1.3.2 RT-PCR檢測(cè)2組組織中miRNA-185表達(dá)情況

將提取的miRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。miRNA-185的序列從Sanger Institute的 miRBase:Sequence數(shù)據(jù)庫(kù)查得。其檢測(cè)步驟為:①在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中,采用poly(A)聚合酶給miRNA添加多聚腺苷酸尾巴;②逆轉(zhuǎn)錄酶將miRNA和 RNA都轉(zhuǎn)化為cDNA;③PCR:oligo-dT引物在 5′末端帶有通用標(biāo)簽,與miScript Universal Primer特異性結(jié)合,并與miRNA-specific primer一起以此確保 PCR過(guò)程中miRNA的特異性擴(kuò)增;④將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。本實(shí)驗(yàn)采用 U6 RNA作為內(nèi)參照,根據(jù) miScript ReverseTranscription Kit說(shuō)明書(shū)分別加入RT-PCR反應(yīng)所需試劑、引物、miRNA樣品等進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄條件:37℃60 min,95℃5 min。PCR條件:95℃15 min,94℃15 s,55℃30 s,70℃34 s;40個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)果用4%瓊脂糖膠上樣電泳,電泳照膠儀下觀(guān)察。將逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增從而準(zhǔn)確驗(yàn)證miRNA-185在2組組織中的表達(dá)情況。

1.3.3 Rea1-time PCR檢測(cè)2組組織中miRNA-185表達(dá)情況

采用SYBR Green熒光染料法,U6 RNA作為內(nèi)參照,循環(huán)閾值(Ct)比較法進(jìn)行miRNA表達(dá)相對(duì)定量分析,從而準(zhǔn)確驗(yàn)證miRNA-185在2組組織中的表達(dá)情況[4]。以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,應(yīng)用 miScript Primer Assay配合 miScript SYBRGreen PCR Kit進(jìn)行Real-time PCR分析;應(yīng)用miScript Universal Primer和miRNA-specific primer(miScript Primer Assay)擴(kuò)增miRNA。Real-time PCR條件:95℃15 min,94℃15 s,55℃30 s,70℃34 s;循環(huán)40次,30 L反應(yīng)體系。隨后繼續(xù)進(jìn)行建立熔解曲線(xiàn)的反應(yīng):95℃變性1 min;在55～95℃的區(qū)間內(nèi)進(jìn)行熔解實(shí)驗(yàn),即緩慢升溫,每個(gè)溫度1個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)30 s,共 40個(gè)循環(huán)。每管設(shè)3個(gè)復(fù)孔,冰上避光操作。反應(yīng)結(jié)束后,電腦自動(dòng)得出熔解曲線(xiàn),結(jié)果用ABI自帶軟件分析。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

目的基因相對(duì)表達(dá)量 =2-ΔΔCt,2-ΔΔCt表示的是腎癌組(作為實(shí)驗(yàn))目的基因表達(dá)相對(duì)于癌旁組(作為對(duì)照)變化的倍數(shù)。在目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相同的情況下可以直接得到目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的定量[5]。ΔΔ Ct=(Ct目的-Ct內(nèi)參)實(shí)驗(yàn)-(Ct目的-Ct內(nèi)參)對(duì)照,把所得到的CT值還原為目的基因的量,進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后符合正態(tài)分布的規(guī)律。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Pearson法,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

1) RT-PCR電泳結(jié)果顯示,miRNA-185和U6 RNA均呈單一條帶,其所處的位置及其在正常組織和癌組織中的表達(dá)情況符合前期的預(yù)計(jì)(圖1),證明相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件和所設(shè)計(jì)的引物均符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 正常組織和腫瘤組織RT-PCR電泳圖

2) Real-time PCR結(jié)果顯示,Real-time PCR根據(jù)所得的熔解曲線(xiàn)可知,miRNA-185及U6 RNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)峰均為單一峰形,未見(jiàn)其他峰值,并且峰的形狀也較銳利,提示無(wú)引物二聚體的生成和干擾,獲得的PCR產(chǎn)物具有特異性,以此為基礎(chǔ)進(jìn)行定量是可靠的。Real-time PCR得到的ΔΔ Ct通過(guò) 2-ΔΔCt可求得目的基因相對(duì)表達(dá)量 ,結(jié)果顯示:miRNA-185在腎癌組組織中呈高表達(dá),較癌旁組織平均升高5.14倍。22例標(biāo)本中有17例(77%)腎癌組組織中 miRNA-185陽(yáng)性表達(dá)率為77.3%(17/22),明顯高于癌旁組的22.7%(5/22)(P＜0.05)。腎癌標(biāo)本中miRNA-185的表達(dá)高于其在癌旁正常組織中的表達(dá),表達(dá)倍數(shù)最大值為29.14,最小值為0.06。

3) G1期的4例腎癌標(biāo)本均較相應(yīng)的癌旁正常組織呈現(xiàn)低表達(dá),高表達(dá)的則離散分布在G2和G3期。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,miRNA-185在腎透明細(xì)胞癌組織中的相對(duì)表達(dá)量與腎癌病理學(xué)分期呈正相關(guān)(r=0.58,P＜0.05)。

3 討論

microRNA是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)植物和人類(lèi)體內(nèi)的非編碼小分子RNA。成熟的microRNA通常為22個(gè)左右的核糖核苷酸組成,在轉(zhuǎn)錄后水平通過(guò)降解目標(biāo)mRNA或抑制翻譯調(diào)節(jié)基因表達(dá),在調(diào)控基因表達(dá)和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有研究表明,miRNAs在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中既可能起到扮演癌基因,也可扮演抑癌基因的角色[6-8],因此miRNA在惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制、早期診斷以及尋找新的治療手段的研究中有著重要的意義。

雖然已經(jīng)明確miRNAs對(duì)腫瘤發(fā)展過(guò)程中基因表達(dá)調(diào)控里有重要作用,但對(duì)于miRNA在腫瘤和正常組織中表達(dá)量的多少還不明確。既往主要采用液相雜交、Nothern blotting檢測(cè)miRNA,靈敏度不高,且miRNA前體和其基因組均可產(chǎn)生非特異性信號(hào),導(dǎo)致特異性降低[9]。筆者通過(guò)poly(A)聚合酶給miRNA添加多聚腺苷酸尾巴,同時(shí),逆轉(zhuǎn)錄酶將 miRNA和 RNA都轉(zhuǎn)化為 cDNA,并通過(guò)miScript UniversalPrimer與 miRNA-specific primer將其擴(kuò)增出來(lái),具有高度特異性、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、成本低廉及通用性好等優(yōu)點(diǎn),可用于檢測(cè)多種目的miRNA。另外,本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),選擇miRNA-185作為研究對(duì)象,分析22例腎透明細(xì)胞癌手術(shù)患者標(biāo)本中癌組織與癌旁正常組織中miRNA-185的表達(dá)情況,并對(duì)組織學(xué)分期進(jìn)行縱向比較,找出腫瘤各期miRNA-185的差異,其高表達(dá)提示miRNA-185在腎透明細(xì)胞癌中很可能具有癌基因作用。

microRNA的發(fā)現(xiàn)在2002年被《Science》雜志列為十大科技突破之首[10],而miRNAs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用研究是目前熱點(diǎn)。盡管已經(jīng)有很大進(jìn)步,但在miRNAs與腫瘤特別是泌尿系腫瘤方面之間還有很多問(wèn)題值得進(jìn)一步的研究。因此尋找特定的microRNA作為泌尿系統(tǒng)腫瘤診斷的指標(biāo)、治療的手段或靶點(diǎn)有可能成為從根本上防治這些疾病的一個(gè)新的突破口。

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