張曉亮, 董素珍

(華東師范大學(xué)腦功能基因組學(xué)教育部、上海市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200062)

＊研究快訊＊

一種新的呫諾美林衍生物促進(jìn)小鼠神經(jīng)元生成

張曉亮, 董素珍

(華東師范大學(xué)腦功能基因組學(xué)教育部、上海市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200062)

0 引 言

毒蕈堿乙酰膽堿受體(M受體)是動(dòng)物體內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)受體,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達(dá)M 1受體.M 1受體與動(dòng)物的認(rèn)知功能及阿爾茨海默病(AD)的神經(jīng)退行性病理過程密切相關(guān).研究表明,許多M 1受體激動(dòng)劑能通過激活M 1受體,緩解AD病理癥狀,并改善AD病人的認(rèn)知能力,因此可以作為潛在的AD治療藥物[1].呫諾美林(Xanomelin)能特異地激活M 1受體,且二期臨床實(shí)驗(yàn)也證明,它具有顯著的AD治療效果.但是,由于引起明顯的外周神經(jīng)系統(tǒng)副作用,它并不能成為真正的AD治療藥物[2].前期研究發(fā)現(xiàn),對(duì)老年小鼠腹腔注射呫諾美林的一種新的衍生物3-[3-(3-(3-flo rophenyl)-2-p ropyn-1-ylthio)-1,2,5-thiadiazol-4-yl]-1,2,5,6-tetrahydro-1-methylpyridine Oxalate(EU K1001),能顯著改善其認(rèn)知能力,增強(qiáng)其海馬突觸可塑性,效果比呫諾美林更顯著.值得注意的是,EUK1001引起的動(dòng)物毒副作用更小.這些結(jié)果表明,EUK1001有望成為一種新的AD治療藥物[3].但 EU K1001改善小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的機(jī)理,目前還不清楚.

已有研究表明,成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)持續(xù)有新的神經(jīng)元生成,新的神經(jīng)元出現(xiàn)的腦區(qū)主要集中在海馬齒狀回(dentate gyrus,DG)的顆粒下層(subgranular zone,SGZ)和腦室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ),并且海馬齒狀回的神經(jīng)生成在動(dòng)物的學(xué)習(xí)與記憶過程中起重要作用[4].另有研究顯示,調(diào)控前腦的乙酰膽堿水平直接影響成年動(dòng)物的神經(jīng)生成及學(xué)習(xí)記憶能力[5].因此,我們推測,EUK1001也能調(diào)控成年動(dòng)物的神經(jīng)生成,這可能是它改善小鼠記憶能力的基礎(chǔ).為了驗(yàn)證這一猜想,我們檢測了 EUK1001處理小鼠后腦內(nèi)神經(jīng)生成的情況.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

EU K1001由北京大學(xué)藥學(xué)院雷小平教授的實(shí)驗(yàn)室合成并提供.將18只7～8周齡的C57BL/6小鼠隨機(jī)分成兩組,即EU K1001組和對(duì)照組.對(duì)EUK1001組每天進(jìn)行1 mg/kg的EUK1001腹腔注射,對(duì)照組給予等量生理鹽水腹腔注射,各持續(xù)15 d.為了檢測小鼠的神經(jīng)生成情況,在給予EUK1001或生理鹽水的最后兩天,兩組小鼠均給予BrdU腹腔注射(100 mg/kg),每天4次,每2 h一次.

1.2 組織固定、取材及切片

在最后一次注射后16 h,麻醉小鼠,暴露心臟,用滅菌生理鹽水灌注5 min,4℃4%多聚甲醛固定30 min.隨后分離出整個(gè)腦組織,投入4%多聚甲醛中,于4℃后固定2 h,然后依次經(jīng)過20%和30%蔗糖溶液脫水至腦組織沉底.將處理好的腦組織在Leica1850切片機(jī)上進(jìn)行冰凍切片,厚度為30μm;切片-20℃保存.

1.3 免疫組化

對(duì)來自EUK1001組或?qū)φ战M小鼠的腦片進(jìn)行免疫組化,詳細(xì)過程參考[6].切片平衡到室溫,1×PBS洗5 min×3次,在95～98℃0.01 mol/L的檸檬酸緩沖液中抗原修復(fù)15 min,然后冷卻20 min.1×PBS洗5 min×3次后,加5%山羊血清封閉2 h,加小鼠源的anti-BrdU抗體(M illipore,1∶5 000)和兔anti-Double Co rtin(DCX)抗體(Abcam,1∶200)4℃孵育過夜.1×PBS 5 min×6次漂洗后,加cy3標(biāo)記的抗小鼠二抗(M illipore,1∶500)和A lexa-488標(biāo)記的抗兔二抗(Invitrogen,1∶1 000)室溫孵育2 h,1×PBS充分沖洗.DAPI復(fù)染5 min,用防淬滅熒光封片劑封片.用Nikon熒光顯微鏡觀察并拍照.計(jì)數(shù)各小鼠腦片DG中BrdU陽性細(xì)胞數(shù),并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié) 果

圖1(A-F)為代表性的EU K1001組和對(duì)照組的免疫組化結(jié)果.在EU K1001處理的動(dòng)物組,每個(gè)海馬的平均BrdU陽性細(xì)胞數(shù)為1 563.4±122.1;而對(duì)照組每個(gè)海馬的平均BrdU陽性細(xì)胞數(shù)為1 012.2±63.9.與對(duì)照組相比,EU K1001組的海馬SGZ及整個(gè)DG的新生神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯增加 (見圖1G,P<0.01),而SVZ的新生神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目則沒有明顯差異 (見圖2).表明 EU K1001處理能促進(jìn)成年小鼠海馬DG的神經(jīng)生成,但對(duì)SVZ神經(jīng)生成則沒有明顯效果.從圖3可以看出,大部分BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)不成熟神經(jīng)元標(biāo)記DCX,因此EU K1001處理能促進(jìn)DG的神經(jīng)元生成.

圖1 EU K1001促進(jìn)海馬SGZ的神經(jīng)生成Fig.1 EU K1001 treatment enhanced hippocampal neurogenesis in mice

圖2 EU K1001處理沒有明顯影響SVZ的神經(jīng)生成Fig.2 EU K1001 treatment had no significant effectson the neurogenesisof SVZ

圖3 BrdU標(biāo)記細(xì)胞大部分為DCX陽性標(biāo)記細(xì)胞,即新生神經(jīng)元Fig.3 Most of the BrdU+cells(red)are labeled w ith DCX(green)

3 討 論

研究表明,乙酰膽堿系統(tǒng)參與調(diào)控成年動(dòng)物海馬的神經(jīng)生成[5].損傷前腦膽堿能神經(jīng)元導(dǎo)致DG神經(jīng)元生成減少,并且伴隨著動(dòng)物空間記憶缺陷[7];而膽堿能激動(dòng)劑physostigmine促進(jìn)DG神經(jīng)元生成,對(duì)SVZ神經(jīng)生成情況則沒有影響[5].前腦乙酰膽堿水平影響新生神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目及新生細(xì)胞的短期生存,但對(duì)長期生存沒有影響[5].同時(shí)新生的神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)M 1受體[5].乙酰膽堿酯酶抑制劑處理增加新生神經(jīng)元的存活,但不影響神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖[8].因此,提升腦內(nèi)乙酰膽堿水平或激活M受體能促進(jìn)新生神經(jīng)元生成或存活.

結(jié)果顯示,15 d的EU K1001腹腔注射能顯著增加年輕成年小鼠的海馬區(qū)的神經(jīng)生成,但不影響SVZ神經(jīng)生成.EUK1001對(duì)SGZ及SVZ神經(jīng)生成的影響不一致,可能與成年動(dòng)物SGZ與SVZ神經(jīng)生成存在不同的調(diào)節(jié)機(jī)制[9]有關(guān),具體原因有待深入研究.EUK1001是M 1受體的激動(dòng)劑[3],因此小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元生成的促進(jìn)可能是由于M 1受體被激活引起的.

EU K1001能改善老年小鼠的認(rèn)知功能缺陷,提高海馬突觸可塑性,相對(duì)于M 1受體激動(dòng)劑呫諾美林有更低的毒性,是潛在的AD治療藥物.本實(shí)驗(yàn)又證實(shí)它能促進(jìn)成年小鼠海馬神經(jīng)生成,這可能是它改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的原因.但是進(jìn)一步的分子機(jī)制還有待深入研究.

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Increased neurogenesis in adultm ice by a novel derivative of xanomeline

ZHANG Xiao-liang, DONG Su-zhen

(Key Lab of B rain Functional Genom ics,MOE&STCSM,East China Normal University,Shanghai 200062,China)

Q189

A

1000-5641(2010)04-0137-04

2010-03

張曉亮,男,碩士研究生.E-mail:zxliang1982@126.com.

董素珍,女,助理研究員.E-mail:szdong@brain.ecnu.edu.cn.