朱華，施錚錚，張虎祥，萬(wàn)麗，楊孝軍，鄭飛云

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000，1.婦產(chǎn)科；2.病理科)

凋亡抑制和增殖能力增強(qiáng)是腫瘤發(fā)生的兩大主要機(jī)制。存活素（Survivin）是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制基因，它是凋亡抑制蛋白（inhibition apoptosis protein，IAP）家族中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的蛋白分子，也是至今發(fā)現(xiàn)抗凋亡作用最強(qiáng)的基因。Survivin基因在正常組織中不表達(dá)，而在幾乎所有被研究的腫瘤組織中呈陽(yáng)性表達(dá)[1]，這一特點(diǎn)為腫瘤的診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)。本研究采用原位雜交法檢測(cè)Survivin在宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）中的表達(dá)，采用免疫組化法檢測(cè)Bcl-2蛋白的表達(dá)，探討兩者在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 宮頸浸潤(rùn)癌81例，CIN 74例，以同期20例正常宮頸組織作對(duì)照。均為取自本院2006年1月-2008年3月間經(jīng)病理證實(shí)的臨床資料較完整的宮頸標(biāo)本?；颊吣挲g19～78歲，平均（40.1±11.2）歲。取材前未接受任何其他治療。所有標(biāo)本及時(shí)以4%多聚甲醛(含有1/1000 DEPC)固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。

1.2 臨床分期、病理分型及病理分級(jí) 74例CIN中包括CINI級(jí)13例，CINII級(jí)26例，CINIII級(jí)35例。81例宮頸浸潤(rùn)癌中包括70例鱗癌和11例腺癌，根據(jù)1970年再次修訂的FLGO臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，分為Ia期9例，Ib期17例，IIa期33例，IIb期12例，III期10例；按組織病理學(xué)分級(jí)分為高分化14例，中分化29例，低分化38例；按照腫瘤生長(zhǎng)類型分為外生型39例，內(nèi)生型15例，潰瘍型16例，頸管型11例。81例宮頸癌患者中54例行廣泛性子宮切除術(shù)＋盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)（包括Ia期3例、Ib期17例、IIa期33例、IIb期1例），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例，無(wú)轉(zhuǎn)移21例。

1.3 主要試劑 鼠抗人Bcl-2多克隆抗體和免疫組化試劑盒（即用型二步法）購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司。Survivin原位雜交檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)有限公司，針對(duì)人Survivin靶基因的mRNA引物序列為：①5’-CCTGG CAGCC CTTTC TCAAG GACCA CCGCA-3’；② 5’-AAGCA TTCGT CCGGT TGCGC TTTCC TTTCT-3’；③ 5’-AGAAA GTGCG CCGTG CCATC GAGCA GCTGG-3’。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 原位雜交法檢測(cè)Survivin mRNA表達(dá)：地高辛標(biāo)記的Survivin mRNA寡核苷酸探針檢測(cè)石蠟包埋組織的Survivin mRNA序列：切片脫蠟，0.5% H2O2室溫處理30 min，加3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶，37 ℃消化，暴露Survivin mRNA核酸片段，滴加預(yù)雜交液，42 ℃恒溫4 h，滴加雜交液，42 ℃恒溫箱過(guò)夜，梯度SSC洗滌，依次滴加封閉液，生物素化鼠抗地高辛，SABC，DAB顯色，復(fù)染，透明，封片鏡檢。以不加Survivin探針只加預(yù)雜交液作為陰性對(duì)照。

1.4.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)：按常規(guī)免疫組化試劑盒即用型二步法操作步驟進(jìn)行。組織切片脫蠟，微波修復(fù)抗原，3% H2O2阻斷劑孵育10 min，PBS液沖洗。加入1:50 Bcl-2鼠抗人單克隆抗體，4 ℃冰箱過(guò)夜。PBS沖洗，加入即用型二抗PV-6000，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明，封片鏡檢。用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性的乳腺癌作陽(yáng)性對(duì)照。所有切片均在相同條件下進(jìn)行。

1.5 結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) Survivin和Bcl-2陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞漿中出現(xiàn)淡黃色至棕黃色顆粒。隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野，按每高倍鏡視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比記分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，大于75%為4分。按著色強(qiáng)度記分：染色呈淡黃色者記為1分，染色呈黃色者記為2分，染色呈棕黃色者記為3分。兩種記分的乘積即為陽(yáng)性強(qiáng)度：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中度陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 率的比較采用x2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 Survivin mRNA，Bcl-2在正常子宮頸、CIN、宮頸癌中的表達(dá)（見表1及圖1～6） Survivin，Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)染色主要定位于細(xì)胞漿，呈淡黃色或棕黃色顆粒，局灶性或彌漫性分布。由表1可見，Survivin，Bcl-2在正常宮頸組織中不表達(dá)，在宮頸癌和CIN中表達(dá)的陽(yáng)性率顯著高于正常宮頸組織（P<0.01），且在宮頸癌中表達(dá)的陽(yáng)性率高于 CIN（P<0.01）。

表1 Survivin，Bcl-2在正常子宮頸、CIN和宮頸癌中的表達(dá)

圖2 Survivin mRNA在CIN中的弱陽(yáng)性表達(dá)(ISH，×400)

圖3 Survivin mRNA在宮頸癌中的陽(yáng)性表達(dá)(ISH，×200)

圖4 Bcl-2在正常宮頸組織中的陰性表達(dá)(SP，×200)

圖5 Bcl-2在CIN中的弱陽(yáng)性表達(dá)(SP，×200)

圖6 Bcl-2在宮頸癌中的陽(yáng)性表達(dá)(SP，×400)

2.2 Survivin，Bcl-2表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系 Survivin，Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤組織分化、臨床分期有關(guān)。Survivin的陽(yáng)性表達(dá)還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),隨著腫瘤組織分化程度的降低和臨床分期的升高，Survivin mRNA表達(dá)陽(yáng)性率逐漸上升。宮頸癌IIb～I(xiàn)II期組與I～I(xiàn)Ia期組間、低分化組與中～高分化組之間，兩者表達(dá)均有差異(分別為P<0.05或P<0.01)；Survivin在宮頸癌有盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽(yáng)性表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.01)，而Bcl-2表達(dá)與宮頸癌的組織病理類型、腫塊生長(zhǎng)類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性(P＞0.05)（見表2）。

表2175 例宮頸組織中Survivin和Bcl-2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

Survivin基因是于1997年由Altier利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體1cDNA在人基因組庫(kù)中首次篩選克隆出，定位于17q25。它是活性最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白，主要通過(guò)間接或直接抑制半胱氨酸蛋白酶caspase-3和caspase-7的活性而發(fā)揮抗凋亡作用[2-3]。

Saiton等[4]采用RT-PCR技術(shù)研究了7種宮頸癌細(xì)胞株和25例宮頸癌組織中Survivin mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在所有的標(biāo)本中均可檢測(cè)到Survivin mRNA。在之后的定量測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，Survivin mRNA的表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞株中高于正常宮頸組織，而在88%的宮頸癌組織中其表達(dá)水平是正常組織的2倍。王梅等[5]又用免疫組化SP法從蛋白水平對(duì)宮頸癌中Survivin進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)59例宮頸癌組織中41例(占69.5%)有Survivin表達(dá)，而在10例正常宮頸組織中未發(fā)現(xiàn)Survivin表達(dá)。本研究亦發(fā)現(xiàn)Survivin mRNA在正常宮頸組織中未表達(dá)，在CIN和宮頸癌組織中逐漸升高，差異有顯著性。隨著組織分化惡性程度的增高，或腫瘤臨床期別的增高，Survivin的陽(yáng)性表達(dá)率亦相應(yīng)上升，且其表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移亦有顯著相關(guān)性。由此表明Survivin基因的表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有密切相關(guān)，它可能預(yù)示著腫瘤具有較高的侵襲性和不良預(yù)后[6]。Survivin可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖而發(fā)揮其作用，因此Survivin基因是一個(gè)有潛在價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物[7]。

Bcl-2基因是最早在B細(xì)胞白血病和濾泡性淋巴瘤的研究中被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制基因，定位于染色體18q21，它可通過(guò)封閉細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高、抗氧化而發(fā)揮抗凋亡作用。它是迄今為止研究較深入的抗凋亡基因之一[8]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白同樣在正常宮頸組織、CIN和宮頸癌中有逐漸增高的表達(dá)，且兩兩之間差異有顯著性，表明Bcl-2基因亦參與了正常宮頸組織-CIN-宮頸癌的病變過(guò)程。

同時(shí)，在本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)Survivin的表達(dá)和Bcl-2有正相關(guān)性，目前兩者協(xié)同致病機(jī)制還不清楚。在CIN階段Survivin和Bcl-2即有表達(dá)，提示此兩基因在宮頸癌惡變的早期即有表達(dá)，且隨著疾病的發(fā)展而進(jìn)一步增強(qiáng)。宮頸癌IIb期以上患者的臨床標(biāo)本出現(xiàn)兩者的高表達(dá)率，低分化標(biāo)本出現(xiàn)高表達(dá)率等均提示兩者表達(dá)與此類患者的不良預(yù)后有關(guān)，對(duì)臨床治療有指導(dǎo)意義。有報(bào)道稱Survivin可在Bcl-2的下游阻斷半胱氨酸蛋白酶caspase-3和caspase-7凋亡調(diào)節(jié)通路[9]。

據(jù)推測(cè)兩者可能通過(guò)相似的啟動(dòng)序列，共同協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致宮頸癌的病變。也可能是由于Survivin基因所在的染色體不穩(wěn)定，導(dǎo)致t（14，18）易位，而引發(fā)Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄激活，而細(xì)胞凋亡途徑的紊亂則有利于腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲。兩基因的異常表達(dá)可能協(xié)調(diào)促進(jìn)細(xì)胞逃離正常的監(jiān)控機(jī)制，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)異常增殖，參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。但由于研究時(shí)間短，缺乏研究對(duì)象生存時(shí)間的隨訪資料，因此聯(lián)合檢測(cè)Survivin和Bcl-2表達(dá)是否為宮頸癌預(yù)后的客觀指標(biāo)還有待深入研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Survivin和Bcl-2在CIN和宮頸癌組織中的異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，兩者呈正相關(guān)，其機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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