金培峰，張浩，鄭亮承，蔣成榜，孫成超

(1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 心胸外科，浙江 溫州 325000；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院 衛(wèi)生部心血管疾病再生醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京 100037)

干細胞治療心肌梗死已被證實是一種較有前景的治療方法。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）由于具有取材容易、體外增殖能力強、低免疫原性、可分化為不同類型的成熟細胞等優(yōu)點[1-2]，成為最佳的移植細胞來源。但是和其他體細胞類似，BMSCs也易受各種因素如：年齡、氧化應(yīng)激和高糖[3-4]等的影響而導(dǎo)致其生物學(xué)性狀改變。

糖尿病患者復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境，包括長期的高血糖、高血脂、酮體的增多、活性氧等，勢必會對自身體內(nèi)的BMSCs產(chǎn)生影響[5-6]。目前國內(nèi)外在干細胞治療心梗的研究中，大多采用正?；蛘吣贻p的BMSCs作為移植細胞來源。為了確定糖尿病體內(nèi)環(huán)境對BMSCs的影響以及其能否作為自體移植的細胞來源，我們將以糖尿病大鼠來源的BMSCs作為研究對象，在體外培養(yǎng)條件下進行一系列的生物學(xué)特性檢測，就此問題進行初步探討。

1 材料和方法

1.1 動物 220g Spraque Dawley(SD)大鼠由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，所有研究都經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物委員會批準。

1.2 主要試劑 DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清購自Gibco公司；鏈脲佐菌素（STZ）、Hoechst 33342購自Sigma公司；細胞低氧培養(yǎng)盒、缺氧催化劑購自BioM6rieux-sa(France)；膜聯(lián)蛋白(annexin)-V FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自R&D公司。

1.3 糖尿病大鼠模型的制備 12只健康的SD大鼠隨機平均分為兩組，分別為糖尿病組和正常對照組。兩組大鼠在禁食12h后分別予單次腹腔注射STZ檸檬酸緩沖液(55mg/kg)和檸檬酸緩沖液。3 d后剪尾靜脈測血糖，以>16.67 mmol/L視為糖尿病模型成功，腹腔注射后3周復(fù)測1次尾靜脈血糖和體重，以確保血糖濃度>16.67 mmol/L。糖尿病模型合格的和正常對照組大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)10周，為下面實驗做準備。

1.4 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng) 無菌條件下分別剝離糖尿病大鼠和正常對照大鼠的股骨和脛骨[3]，以全骨髓貼壁法分離并培養(yǎng)BMSCs，待狀態(tài)良好的第二代細胞生長達到70%～80%匯合時可用于以下實驗。

1.5 細胞增殖能力檢測 取生長良好的第二代骨髓間充質(zhì)干細胞，于96孔板的每個孔中加入100μL細胞懸液，細胞數(shù)為1.5×103，培養(yǎng)基每2天更換一次。于細胞接種后的7 d內(nèi)，每天取5個孔進行檢測，每個孔內(nèi)加入CCK-8試劑10μL，置培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，用全自動酶標儀檢測490 nm（參比波長630 nm）的吸光度值（OD值），取平均值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，以相應(yīng)的OD值為縱坐標，描繪生長曲線。

1.6 間充質(zhì)干細胞凋亡的檢測

1.6.1 細胞模擬缺血處理(無血清和低氧聯(lián)合處理)：當?shù)诙毎L達到70%～80%匯合時用PBS沖洗2次，加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，然后迅速將細胞放入密閉低氧罐中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h。

1.6.2 形態(tài)學(xué)檢測：將進行低氧和無血清處理后的細胞用PBS洗1次，然后加入含Hoechst33342的無血清DMEM培養(yǎng)基，Hoechst33342終濃度為0.1 mg/mL，室溫避光反應(yīng)10 min。用熒光顯微鏡觀察，紫外光激發(fā)，觀察凋亡細胞并攝片。

1.6.3 流式檢測：取經(jīng)低氧無血清處理的7×105個細胞，用0.125%胰蛋白酶/0.04% EDTA消化細胞后，4 ℃，以800 r/min離心4 min后，棄掉上清液；細胞用PBS沖洗1次后懸浮于200μL結(jié)合緩沖液。然后加入10μL 20μg/mL的異硫氰酸熒光素(FITC)標記的膜聯(lián)蛋白V(膜聯(lián)蛋白-V-FITC)，輕輕混勻后，4 ℃避光反應(yīng)15 min。加入5μL 50μg/mL的PI，300μL結(jié)合緩沖液，輕輕混勻，用流式細胞儀檢測活細胞、早期和中晚期凋亡細胞及壞死細胞所占的比例。

1.7 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和胰島素生長因子-1（IGF-1）的ELISA檢測 將生長良好的第二代骨髓間充質(zhì)干細胞用PBS沖洗1次后，添加不含血清DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h后，取上清液備用。按照ELISA試劑盒操作說明書，用雙抗體夾心法分別檢測細胞培養(yǎng)上清中VEGF和IGF-1的含量，每份標本設(shè)3個復(fù)孔。用全自動酶標儀測450 nm處吸光度值，取其平均值，根據(jù)所繪制的標準曲線計算出各個細胞因子的含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用獨立樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs的培養(yǎng)和增殖能力檢測 采用常規(guī)細胞原代培養(yǎng)法，成功培養(yǎng)了糖尿病大鼠的BMSCs。相差顯微鏡下對細胞形態(tài)進行了觀察，如圖1A所示培養(yǎng)的原代細胞呈長梭型，集落生長，中間較密，夾雜著圓形高亮未貼壁的雜細胞，但是糖尿病大鼠的BMSCs所形成的集落較正常大鼠的明顯要小，而且貼壁后4～5 d才表現(xiàn)出成纖維樣生長特性。細胞傳代后，在第1代和第2代細胞生長呈現(xiàn)明顯的漩渦狀，但是相對于正常大鼠BMSCs飽滿的細胞形態(tài)，糖尿病大鼠的則表現(xiàn)為細胞伸展無力，且較為扁平。本實驗所用細胞均為第2代BMSCs。利用CCK-8檢測的結(jié)果顯示(見圖1B)，糖尿病來源的骨髓間充質(zhì)干細胞增殖能力明顯較正常來源的低（P<0.01)。

圖1 A 在原代中，糖尿病組所形成的細胞集落明顯較正常組小，經(jīng)傳代后細胞較正常的扁平并且伸展無力圖1B 在第1天和第2天，兩組細胞生長并無差異，隨時間增長，糖尿病組生長明顯較正常的減慢（*P<0.05，**P<0.01)

2.2 VEGF和IGF-1的分泌量 ELISA結(jié)果（見圖2）顯示糖尿病大鼠來源BMSCs的VEGF和IGF-1的分泌量較正常來源的明顯降低(分別為P<0.05，P<0.01)。

圖2 A，2B 糖尿病來源的骨髓間充質(zhì)干細胞分泌的VEGF和IGF-1的量較正常組顯著降低（*P<0.05，**P<0.01）

2.3 細胞凋亡 在缺血無血清聯(lián)合處理后(圖3A)，相差顯微鏡照片可以顯示明顯的細胞凋亡表征，即胞核皺縮變圓，貼壁細胞數(shù)量明顯地減少。Hoechst33342染色后，正常細胞核呈彌散均勻的熒光， 而凋亡的細胞， 細胞核與細胞質(zhì)中可見濃染致密的顆粒熒光， 被認為是典型的凋亡細胞。

圖3 A 凋亡預(yù)處理后，經(jīng)Hoechst33342染色后細胞核為濃染致密的顆粒熒光；圖3B示經(jīng)流式細胞學(xué)檢測后，糖尿病組凋亡系數(shù)較正常組明顯增高 (**P<0.01)

2.4 膜聯(lián)蛋白V/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡膜聯(lián)蛋白 糖尿病來源的BMSCs中早期凋亡細胞(膜聯(lián)蛋白為V+/PI-）較正常大鼠來源的明顯增多（P<0.01，見圖3B)；中晚期凋亡細胞（V+/PI+）和死亡細胞（V-/PI+）兩者差異無顯著性（P>0.05）。

3 討論

隨著冠心病發(fā)病機制研究的深入，更多的證據(jù)表明，作為代謝綜合征之一的糖尿病和冠心病的發(fā)生有著密切的關(guān)系[5]。而糖尿病患者體內(nèi)的高糖、酮體、氧化產(chǎn)物等有害物質(zhì)的增多，勢必對自體來源的BMSCs的性狀產(chǎn)生影響。在本研究中我們通過利用STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，在經(jīng)體外培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，糖尿病來源的BMSCs在增殖能力上明顯減弱，并且在細胞的分泌和抗凋亡能力上也較正常大鼠來源的顯著降低。

在BMSCs治療心肌梗死的研究中，首先要在體外擴增得到移植所需的細胞量。我們在研究中發(fā)現(xiàn)，在原代培養(yǎng)中糖尿病來源細胞在貼壁后4～5 d才表現(xiàn)出成纖維樣生長的特性，且糖尿病來源的BMSCs的增殖能力明顯降低，并且細胞較為扁平。原代體外貼壁時間的延長和細胞形態(tài)的變化說明其對環(huán)境的適應(yīng)能力降低，需要較長的時間來恢復(fù)其生長增殖能力。另外有研究表明，傳代后細胞變?yōu)楸馄剑哂羞@樣的形態(tài)特征為細胞衰老的表象[7]，并且與我們所得出的增殖能力的下降是相一致的。

另外在BMSCs移植提高梗死后的心功能上，干細胞所分泌的細胞因子被認為是提高心功能的主要因素之一[8]，其中VEGF和IGF-1在促進新生血管的生成和細胞增殖方面起著非常重要的作用。我們的研究表明，糖尿病來源的BMSCs其VEGF和IGF-1分泌量較正常來源的明顯降低。Liu等[9]利用高糖培養(yǎng)多功能前體細胞后，VEGF的分泌量也可以得到類似的結(jié)果，但是其細胞來源為正常的幼年大鼠。在本實驗中所采用的干細胞培養(yǎng)條件為正常的培養(yǎng)條件，說明糖尿病的體內(nèi)環(huán)境對糖尿病來源的干細胞其分泌能力有不可逆的損害作用。另據(jù)研究表明，VEGF和IGF-1在糖尿病患者的腎臟和視網(wǎng)膜以及血液中的濃度明顯高于正常水平[10]，但是糖尿病自身來源的BMSCs所分泌的VEGF和IGF-1較正常的明顯降低，造成這種矛盾的結(jié)果，可能是不同的組織來源的細胞對于糖尿病內(nèi)環(huán)境的反應(yīng)性不同，并且VEGF和IGF-1在糖尿病腎病和視網(wǎng)膜病變等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展中起著重要的作用。至于細胞移植后分泌的細胞因子，是否會加速糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展進程，需要更深入地研究。

影響干細胞治療心梗療效的另一重要因素是在干細胞移植后細胞在心梗區(qū)的存活率較低，而心肌梗死區(qū)缺血低氧的環(huán)境是導(dǎo)致細胞凋亡的主要原因。我們采用體外低氧無血清的方法建立細胞凋亡模型[11]，發(fā)現(xiàn)糖尿病組的抗凋亡能力明顯較正常組下降?，F(xiàn)有的體外研究表明，體外的高糖、丙酮醛類、活性氧產(chǎn)物（ROS）等環(huán)境對細胞的凋亡起著很大的促進作用，而這些因素在糖尿病患者中均存在。另外，VEGF的分泌減少和糖尿病BMSCs在體外培養(yǎng)條件下的所表現(xiàn)出細胞衰老的形態(tài)學(xué)特征，抗細胞凋亡能力的下降也起著重要的促進作用。

目前關(guān)于糖尿病大鼠來源的BMSCs在增殖、分泌和抗凋亡能力下降方面的確切機制目前尚不清楚，可能與糖尿病體內(nèi)復(fù)雜的病理生理條件造成干細胞的線粒體功能障礙[12]、高糖所導(dǎo)致的細胞復(fù)制性衰老[3]和相應(yīng)的信號通道阻斷等有關(guān)[9]。在本實驗中，我們選擇均為同齡的大鼠作為實驗對象，避免了因年齡不同而造成的誤差；在細胞培養(yǎng)方面，均在體外正常的培養(yǎng)條件下進行，從而可以得出糖尿病對BMSCs的各種生物學(xué)性狀的損害是客觀存在的。

本研究也存在若干不足，如沒有將培養(yǎng)得到的糖尿病BMSCs移植回動物心梗模型體內(nèi)，檢測其對心功能的改善情況。另外，在糖尿病來源的BMSCs在抗凋亡能力、增殖能力和分泌能力損傷的機制上，沒有做進一步的探討，這也是我們下一步實驗的方向。

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