沈海娥,李 冀,路 瑤,張文麗,任興波,布仁滿都呼,田喜鳳

2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083;

3.華北煤炭醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室電鏡室,唐山 063000;

4.華北煤炭醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系生物技術(shù)專業(yè),唐山063000

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體染色體掃描電鏡觀察*

沈海娥1,李 冀1,路 瑤2,張文麗3,任興波4,布仁滿都呼4,田喜鳳1

目的電鏡觀察藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體的染色體數(shù)目及形態(tài)。方法 用改良TYI-S-33培養(yǎng)基培養(yǎng)賈第蟲滋養(yǎng)體。制備分散度較好的染色體玻片標(biāo)本,對(duì)玻片標(biāo)本進(jìn)行掃描電鏡常規(guī)處理,掃描電鏡觀察。結(jié)果 在掃描電鏡下觀察到了藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體的染色體,染色體數(shù)目為2n=10條,1號(hào)染色體為亞中央著絲粒染色體,2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、5號(hào)為端著絲粒染色體。結(jié)論 通過電鏡觀察認(rèn)為藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體的染色體核型公式為2n=10=2sm+8t。

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲;滋養(yǎng)體;染色體;掃描電鏡

2.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083;

3.華北煤炭醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室電鏡室,唐山 063000;

4.華北煤炭醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系生物技術(shù)專業(yè),唐山063000

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia,簡(jiǎn)稱賈第蟲)的滋養(yǎng)體寄生于人體小腸,導(dǎo)致以腹瀉和營(yíng)養(yǎng)不良為主要臨床表現(xiàn)的藍(lán)氏賈第蟲鞭毛蟲病。賈第蟲是一種單細(xì)胞真核生物,是目前所知的最原始的真核生物。由于特殊的進(jìn)化地位,國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都熱衷于它的細(xì)胞學(xué)研究,以探討原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的進(jìn)化。從1952年起,國(guó)內(nèi)外學(xué)者就對(duì)其是否具有典型染色體以及染色體的數(shù)目展開了研究〔1〕。

本實(shí)驗(yàn)室在光學(xué)顯微鏡下初步觀察到了賈第蟲滋養(yǎng)體的染色體,但染色體體積微小,呈點(diǎn)狀,屬于微小染色體〔2〕,所以關(guān)于染色體的形態(tài)還不甚清楚。近年來,應(yīng)用掃描電鏡研究人類和動(dòng)物的染色體日益增多〔3-4〕,利用掃描電鏡觀察染色體特別是微小染色體的數(shù)目、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等核型的觀察提供了新途徑。本研究應(yīng)用掃描電鏡首次觀察了賈第蟲滋養(yǎng)體的染色體,并對(duì)其核型進(jìn)行了初步分析,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1 蟲株 選用藍(lán)氏賈第鞭毛蟲C2株。基因型屬于第3型(GS)。該株蟲體系分離自我國(guó)四川省農(nóng)村1名腹瀉患兒〔5〕,隨后用改良T YI-S-33培養(yǎng)基建立的純培養(yǎng)〔6〕。蟲株由首都醫(yī)科大學(xué)寄生蟲教研室用液氮冷凍保種。實(shí)驗(yàn)前,將凍存的滋養(yǎng)體復(fù)蘇,置上述培養(yǎng)基內(nèi)于37℃培養(yǎng)、傳代。

1.2 染色體標(biāo)本制備 取蟲體生長(zhǎng)旺盛的培養(yǎng)管,棄去舊培養(yǎng)基,加入含秋水仙素的新鮮培養(yǎng)基(秋水仙素終濃度為 0.2μ g/mL),繼續(xù)于 37℃培養(yǎng) 4～5h。終止培養(yǎng)后,常溫下用力震蕩培養(yǎng)瓶,使貼于管壁的蟲體脫落。然后收集細(xì)胞,0.075 mol/L KCl溶液低滲,固定液(甲醇:冰醋酸的體積比為3∶1)固定,離心收集細(xì)胞進(jìn)行滴片,在37℃水浴鍋中用Giemsa染液染色1h,自來水沖洗,晾干〔2〕。

1.3 顯微鏡觀察 將染色玻片用油鏡觀察。從染色體標(biāo)本中選取分散較好的中期分裂相細(xì)胞。在分裂相周圍作2mm直徑的標(biāo)記,以便掃描電鏡觀察。

1.4 掃描電鏡標(biāo)本制備 按 Harrison〔3〕的方法,依次:3∶1甲醇-冰乙酸脫色,用磷酸緩沖液洗。2.5%戊二醛固定30min。0.1 mol/L(pH7.4)PBS漂洗3次。1%鋨酸固定 5min。蒸餾水洗 3次。2%單寧酸處理5 min。蒸餾水洗3次。1%鋨酸處理10 min。水洗 3次。30%-100%乙醇逐級(jí)脫水,每級(jí)5min。臨界點(diǎn)干燥(也可用空氣干燥)。把標(biāo)本片標(biāo)記的核型所在處用玻璃切下約5×5mm2,置日立E-1010型離子濺射儀中噴金。

1.5 掃描電鏡觀察 KYKY-2800掃描電鏡觀察。選擇5個(gè)分散良好的分裂相,用游標(biāo)卡尺直接測(cè)量染色體長(zhǎng)度。計(jì)算5對(duì)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度、臂比值。按照染色體大小和形態(tài)依次配對(duì)、編號(hào)、排核型圖,翻拍,放大。

2 結(jié) 果

2.1 光學(xué)顯微鏡觀察賈第蟲滋養(yǎng)體細(xì)胞核輪廓已不清晰,核內(nèi)外有分散的染色體,染色體數(shù)目為10條,染色體體積微小,呈粗大的點(diǎn)狀或短棒狀(圖1左側(cè)細(xì)胞核)。

2.2 掃描電鏡觀察

2.2.1 染色體數(shù)目 兩個(gè)細(xì)胞核輪廓清晰,內(nèi)有分散的染色體,見圖2。兩個(gè)細(xì)胞核的染色體都溢到核外,左側(cè)一組染色體分散良好,形態(tài)清晰。核內(nèi)染色體數(shù)目為2n=10條,見圖3。綜合光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察結(jié)果證明賈第蟲滋養(yǎng)體每個(gè)核內(nèi)染色體數(shù)目為2n=10條,為二倍體。

2.2.2 染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成及核型分析經(jīng)測(cè)量分析可將賈第蟲滋養(yǎng)體的10條染色體配為5對(duì),染色體平均長(zhǎng)度為 0.76μ m,為微小染色體,見表1。根據(jù)染色體核型的相對(duì)長(zhǎng)度、臂比值及著絲粒的位置進(jìn)行分析,剪貼,配對(duì)制成核型圖,見圖4。該核型中1號(hào)染色體為亞中央著絲粒染色體,2-5號(hào)為端著絲粒染色體。其核型公式是2n=10=2sm+8t。根據(jù)核型圖繪制核型模式圖,見圖5。

圖1 染色體體積微小,呈短棒狀(×1 000)光鏡下Fig.1 The chromosomes are short rod in shape and the size is tiny(×1000)light microscope圖2 兩個(gè)細(xì)胞核輪廓清晰,內(nèi)有分散的染色體(×5000)掃描電鏡下Fig.2 There are scattered chromosomes in the two nuclei with clear outline(×5000)scanning electron microscopy圖3 兩個(gè)細(xì)胞核的染色體都溢到核外,左側(cè)一組染色體分散良好,形態(tài)清晰(×5000)Fig.3 Chromosomes are outside of the two nuclei,the left of a group of chromosome is well-dispersed and the morphology is clear(×5000)圖4 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體染色體中期分裂相及核型圖Fig.4 Metaphase chromosomes and the karyotype of Giardia lambliab trophozoite圖5 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體染色體核型模式圖Fig.5 Idiogram of Giardia lambliab trophozoite

表1 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體的核型指數(shù)Tab.1 Relative length,arm ratio,classified set of chromosome of Giardia lamblia

3 討 論

90年代國(guó)內(nèi)學(xué)者利用電鏡對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體的核分裂進(jìn)行了初步觀察,發(fā)現(xiàn)核分裂過程最主要的特征是無凝聚的典型中期染色體出現(xiàn)〔7〕。但隨后吳剛等人利用SDS凝膠電泳證實(shí)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體已存在5種組蛋白〔8〕,陳泳宏等人采用改進(jìn)的染色質(zhì)鋪展技術(shù)制備核小體并進(jìn)行透射電鏡觀察,結(jié)果表明藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體已有了直徑約10nm的核小體結(jié)構(gòu)〔9〕,Adam等確定了端粒的序列為TAGGG,存在于賈第蟲所有染色體分子上〔10〕,這些研究在分子水平上間接證明了具有染色體的可能性。作者在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過長(zhǎng)期的摸索和試驗(yàn),首次在光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡下觀察到成形的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體C2株染色體。

Le Blancq〔11〕和 Adam〔12〕等用脈沖場(chǎng)凝膠電泳對(duì)WB株全基因組DNA進(jìn)行分析,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)至少有5條不同長(zhǎng)度的染色體。但關(guān)于細(xì)胞核是幾倍體還尚未定論。Fan等1991年對(duì)限制性酶解的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體DNA片段進(jìn)行密度掃描,推測(cè)其為單倍體,染色體數(shù)目為5條〔13〕。Adam從其每個(gè)染色體的分子量和總的分子量相比較認(rèn)為其為多倍體〔14〕。Bernander等利用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡研究認(rèn)為在滋養(yǎng)體階段每一個(gè)細(xì)胞核都為二倍體,而不是單倍體〔15〕。截至目前,基本認(rèn)同的觀點(diǎn)是賈第蟲滋養(yǎng)體至少含有5條不同長(zhǎng)度的染色體。作者經(jīng)過對(duì)大量的分裂相細(xì)胞進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì),初步認(rèn)為賈第蟲C2株每一個(gè)細(xì)胞核內(nèi)含有10條染色體,根據(jù)染色體體積大小、形態(tài)、染色等特征推測(cè)其為二倍體(2n),并進(jìn)行了初步的配對(duì)和編號(hào)。

在實(shí)驗(yàn)過程中偶爾發(fā)現(xiàn)兩個(gè)細(xì)胞核內(nèi)的染色體數(shù)不一樣,見圖1,例如一側(cè)為10條,另一側(cè)為 9條或8條,原因可能是:制片中染色體溢出核外,部分染色體丟失,導(dǎo)致2個(gè)細(xì)胞核的染色體數(shù)不同;在數(shù)次細(xì)胞分裂過程中染色體發(fā)生斷裂,一側(cè)細(xì)胞核的染色體發(fā)生丟失,最終兩個(gè)核的染色體數(shù)不同。此現(xiàn)象還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察。

Adam等用脈沖場(chǎng)凝膠電泳對(duì)WB株全基因組DNA進(jìn)行分析,推測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲滋養(yǎng)體每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)至少有5條不同長(zhǎng)度的染色體,同時(shí)推測(cè)了每一條染色體的大小,1和2號(hào)染色體長(zhǎng)度各為1.6Mb,3號(hào)為1.6Mb,4號(hào)為3.0Mb,5號(hào)為3.8Mb,單倍體基因組不超過12Mb〔14〕,最小的染色體定為1號(hào),由小到大依次編號(hào)。而我們則按照核型的常規(guī)規(guī)定,體積最大的染色體定為1號(hào),按體積大小依次編號(hào),所以我們對(duì)染色體的編號(hào)正好與Adam相反,我們所定的1號(hào)染色體即Adam的5號(hào)染色體,其它以此類推。

在掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)1號(hào)染色體為亞中央著絲粒染色體,2-5號(hào)為端著絲粒染色體。由于染色體體積微小,在光學(xué)顯微鏡下呈粗大的點(diǎn)狀,對(duì)于一些常見的染色體分帶技術(shù)如顯示次縊痕的N帶、常規(guī)的G顯帶技術(shù)無法有效的應(yīng)用,所以有關(guān)染色體的詳細(xì)特征比如有無次縊痕,有無隨體,有無核仁組織區(qū)還需進(jìn)一步研究。

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Scanning electron microscope observation on chromosome ofGiardia lambliatrophozoite

SHEN Hai-e1,LI Ji1,LU Yao2,ZHANG Wen-li3,REN Xing-bo4,Burenmanduhu4,TIAN Xi-feng1

(1.Department of Biological Science,North China Coal Medical University;
2.Biosciences and Biotechnology of Beijng Forestry University,Beijing100083;
3.Electron Microscopy Room,Central Laboratory,North China Coal Medical University;
4.Bio-technology,Biosciences Department of North China Coal Medical University,Tangshan063000,China)

In order to observe the quantity for chromosome and shape ofGiardia lambliatrophozoites under scanning electron microscopy,trophozoites were culturedin modified TYI-S-33 medium at 37℃and chromosome slides with better dispersion were prepared.Chromosome on the conventional treatment processed slide was observed under scanning electron microscopy.The chromosome ofGiardia lambliatrophozoite was observed with a quantity of 2n=10.The pair 1 was submetacentric chromosome,while the pair 2,3,4 and 5 were all telocentric chromosomes.It＇s demonstrated that the karyogram formula is 2n=10=2sm+8t under scanning electron microscope.

Giardia lamblia;trophozoite;chromosome;scanning electron microscopy

R382.2

B

1002-2694(2010)07-0696-03

*國(guó)家自然科學(xué)基金(No.30970313)資助

田喜鳳,Email:tstianxifeng@163.com

1.華北煤炭醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)系,唐山 063000;

2010-01-28;

2010-05-11