侯睿哲,侯睿智,彭云香,侯治富*

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130033)

大腸腫瘤p53和ki-ras基因協(xié)同突變的研究

侯睿哲1,侯睿智2,彭云香2,侯治富2*

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130033)

目的探討大腸腫瘤p53和ki-ras基因協(xié)同突變的臨床意義。方法采用免疫組化和PCR-SSCP方法,檢測(cè)58例大腸腫瘤患者的良性病變、良性病變轉(zhuǎn)為惡變、原發(fā)腺癌組織的p53基因、ki-ras基因的表達(dá)和突變情況。結(jié)果良性病變組與惡變組間的p53基因和Ki-ras基因的表達(dá)有顯著差異,良性病變組與原發(fā)腺癌組的Ki-ras基因表達(dá)差異顯著;良性病變組的p53基因與Ki-ras基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),而惡變組和原發(fā)腺癌組呈正相關(guān)。p53基因和ki-ras基因兩種基因突變率無(wú)顯著差異,而協(xié)同突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.335,P=0.017,P＜0.05。結(jié)論p53和ki-ras基因協(xié)同突變可以促進(jìn)了大腸癌的發(fā)展。監(jiān)測(cè)p53基因和Ki-ras基因的協(xié)同表達(dá)和突變,有助于大腸腫瘤的早期診斷和預(yù)后評(píng)價(jià)。

p53基因;ki-ras基因;大腸腫瘤;協(xié)同突變

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告,惡性腫瘤每年全球新發(fā)病例 1000多萬(wàn),死亡700多萬(wàn),占總死亡人數(shù)的12%,在多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家這一數(shù)字可達(dá)25% 。預(yù)期到2020年,在發(fā)展中國(guó)家,將增長(zhǎng)73%。結(jié)腸、直腸癌在我國(guó)仍然高居惡性腫瘤發(fā)病的前十位。盡管p 53基因和ki-ras基因與大腸腫瘤的研究提出較早,也較多,我們的前期工作中也做過(guò)諸多探討。2000年以來(lái),《Nature》等雜志相繼報(bào)道了對(duì)p53基因和kiras基因新的認(rèn)識(shí)。Levine等學(xué)者提出了p53基因網(wǎng)絡(luò)的概念[1],還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了 p53抑癌新機(jī)制等[2,3],并有學(xué)者提出了ki-ras基因可以作為大腸腫瘤早期篩查的指標(biāo)。為了進(jìn)一步闡明p 53基因和ki-ras基因與大腸腫瘤的關(guān)系,本文對(duì)58例大腸腫瘤患者的良性病變、癌組織,采用免疫組化、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)像多態(tài)性(PCR-SSCP)分析法,同時(shí)檢測(cè)p53和ki-ras基因表達(dá)及其突變情況,并對(duì)兩者的協(xié)同突變進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源與分組 58例病人均為吉林大學(xué)白求恩第三醫(yī)院住院患者,男35例,女23例。年齡28-82歲。良性病變組5例,由良性病變轉(zhuǎn)為惡變組9例,原發(fā)腸癌組44例。術(shù)后病理有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例,無(wú)轉(zhuǎn)移者38例。全部標(biāo)本均經(jīng)病理診斷證實(shí)。取材前均未接受放、化療。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶等工具酶購(gòu)自Promega公司;p53和ki-ras免疫組化檢測(cè)試劑購(gòu)于博士德生物工程有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的p53和ki-ras基因序列,采用引物設(shè)計(jì)軟件,按引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)。并在上、下游引物分別引入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。由上海生工生物工程公司合成(見(jiàn)表.1)。

Tab.1 Primer sequence of exons of p53 and Ki-ras

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 切片制備 石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片,厚度4 μ m,常規(guī) HE 染色 。

1.4.2 免疫組化染色 以正常大腸粘膜組織為陽(yáng)性對(duì)照,以PBS為陰性對(duì)照。切片常規(guī)脫蠟、水化,微波修復(fù)抗原,按試劑盒說(shuō)明染色,經(jīng)DAB顯色,蘇木精復(fù)染,干燥、透明、封片,顯微鏡下計(jì)數(shù)結(jié)果。

1.4.3 結(jié)果判定 p53表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi),ki-ras表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。在核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顯色者定為陽(yáng)性細(xì)胞。觀察切片中10個(gè)具有代表性的高倍視野,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)小于10%定為(-),大于10%為(+)。

1.5 PCR-SSCP方法 酚氯仿經(jīng)典法制備樣本DNA,按引物設(shè)計(jì)列表進(jìn)行PCR-SSCP分析p53基因5-8外顯子和Ki-ras基因第一外顯子突變。若出現(xiàn)額外條帶或出現(xiàn)條帶遷移率異常即為陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用t檢驗(yàn)、相關(guān)分析和 χ2檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 大腸腫瘤p53基因和ki-ras基因協(xié)同表達(dá)分析

在58例大腸腫瘤中,p53基因和Ki-ras基因的表達(dá)結(jié)果為:5例良性病變患者的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為57.90±16.03和87.90±3.00,9例惡變組患者的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為74.89±13.04和58.65±17.17,44例原發(fā)腺癌組患者的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為66.43±14.41和62.11±18.75。統(tǒng)計(jì)分析表明,良性病變組與惡變組p53基因和Ki-ras基因的表達(dá)有顯著差異(t分別為2.027 1和4.782 3,P分別＜0.05和＜0.01);惡變組與原發(fā)腺癌組間無(wú)顯著差異(t分別為1.664 5和0.537 1,P均＞0.05);良性病變組與原發(fā)腺癌組的Ki-ras基因表達(dá)差異顯著(t為8.257 8,P＜0.01),而 p53基因表達(dá)無(wú)顯著差異(t為1.1174,P＞0.05)。經(jīng)相關(guān)分析表明,良性病變組p53基因與Ki-ras基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān),而惡變組和原發(fā)腺癌組呈正相關(guān)。

2.2 大腸腫瘤p53基因和ki-ras基因協(xié)同突變分析

對(duì)9例惡變患者和44例原發(fā)腺癌患者癌組織p53基因和ki-ras基因突變進(jìn)行了PCR-SSCP分析,其中3例未出結(jié)果。50例檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn),p53基因和ki-ras基因突變率均近半數(shù)(分別為22/50和23/50,P=0.841),兩種基因突變率無(wú)顯著差異(P＞0.05)。協(xié)同突變結(jié)果(見(jiàn)表2)相關(guān)分析表明,p53+/Kiras mut組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、p53 mut/Kiras+組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、p53+/Kiras+組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率無(wú)顯著差異(P=1.0)。但兩者同時(shí)突變對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有疊加作用,其轉(zhuǎn)移率顯著增高(77.78%),p53基因和ki-ras基因協(xié)同突變與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.335,P=0.017。

Tab.2 Collaborative mutation of p53 gene and Ki-ras gene in colorectal cancer

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生,是多基因參與和多步驟的演化過(guò)程。惡性腫瘤形成后,癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)不斷的突變和選擇,其生物學(xué)行為逐步升級(jí)為惡性行,包括侵潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及治療過(guò)程中發(fā)生的抗放射性、抗藥性,理應(yīng)涉及許多基因的的激活并參與作用,但目前僅惡性變而言,需要多少個(gè)腫瘤基因參與[4]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn),在大腸腫瘤發(fā)生演變過(guò)程中,有多種基因構(gòu)成了龐大復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),其中,p53基因和Ki-ras基因均位于網(wǎng)絡(luò)的上游,其突變與外界因素直接相關(guān),突變后通過(guò)其下游基因群,間接影響細(xì)胞周期,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞惡性增值[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,大腸腫瘤,從良性病變、到良性病變的惡變、以及原發(fā)腺癌演進(jìn)過(guò)程,伴隨著p53基因的表達(dá)逐漸增高和Ki-ras基因表達(dá)的逐漸降低,并在良性病變階段p53基因與Ki-ras基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān),而惡變和原發(fā)腺癌階段呈正相關(guān)。提示在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)同一水平的基因之間仍然存在著制約或協(xié)同作用,這一結(jié)果也驗(yàn)證了基因突變過(guò)程與癌細(xì)胞內(nèi)在功能機(jī)制的協(xié)同特征。

Land等[5]提出,腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化需要特征性癌基因的多重突變,對(duì)癌基因突變起協(xié)同作用的基因可能是細(xì)胞惡變的“啟動(dòng)子”。間接提示了腫瘤多基因突變,是兩個(gè)或兩個(gè)以上功能完全獨(dú)立的癌基因激活或抑癌基因失活才致癌,并有“正調(diào)和負(fù)調(diào)基因突變,癌基因和抑癌基因的協(xié)同致惡變”的多基因協(xié)同假說(shuō),一般需要一個(gè)核內(nèi)蛋白,另一個(gè)胞質(zhì)內(nèi)蛋白。本研究中的p53基因表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi),而Ki-ras基因表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),兩者的協(xié)同作用符合多基因協(xié)同假說(shuō)的機(jī)制。按照共識(shí)性研究基礎(chǔ),大腸腫瘤的演變,包括了增殖、分化或凋亡異常,其發(fā)展進(jìn)程為:息肉/早期腺瘤→中期腺瘤→后期腺瘤→腺癌→轉(zhuǎn)移,期間伴隨的基因異常次序?yàn)?APC/MCC→K-ras→DCC →P53→MMR。并普遍認(rèn)為p53基因突變者預(yù)后差。本研究中的大腸癌的p53基因突變率(44.00%)與Ki-ras基因突變率(46.00%)均接近半數(shù),表明了基因突變?cè)诖竽c癌發(fā)生中的作用不可忽視,但在協(xié)同突變分析中,這兩個(gè)基因沒(méi)有發(fā)生突變者(p53+/Ki-ras+28.00%)與僅一個(gè)基因突變者(p53+/Ki-ras mut 28.00%;p53 mut/Ki-ras+26.00%)的差異并不顯著,揭示單基因突變比多基因協(xié)同突變(p53 mut/Ki-ras mut 18.00%)更常見(jiàn)。但單基因突變對(duì)預(yù)后的影響并不顯著,無(wú)基因突變患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率僅為21.43%,而單基因突變患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率略有增高,差異不顯著(p53+/Ki-ras mut 35.71%;p53 mut/Ki-ras+38.46%)。多基因協(xié)同突變者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高達(dá)77.78%(r=0.335,P＜0.05),揭示了多基因協(xié)同突變的重要性。因此,監(jiān)測(cè)p53基因和Ki-ras基因的協(xié)同表達(dá)和突變,有助于大腸腫瘤的早期診斷和預(yù)后判斷。

[1]Vogelstein B,Lane D,Levine AJ.Surfing the p53 network[J].Nature,2000,16,408:307.

[2]Wang SP,Wang WL,Chang YL et al.p53 controls cancer cell invasion by inducing the MDM2-mediated degradation of Slug[J].Nature Cell Biology,2009,11,694.

[3]He L,He XY,Lim LP,et al.A microRNA component of the p53 tumour suppressor network[J].Nature,2007,447,1130.

[4]Ding L,Getz G,WheelerDA,et al.Somatic mutations affect key pathways in lung adenocarcinoma[J].Nature,2008,455(7216):1069.

[5]侯治富,王維忠,印 璞,等.大腸腫瘤基因調(diào)控模式初探[J].中國(guó)腫瘤臨床,1999,26(11):856.

[6]Land H,Parada LF,Weinberg RA.Cellular oncogenes and multistep carcinogenesis[J].Science,1983,222(4625):771.

Collaborative mutation of p53 and ki-ras genes in colorectal cancer

HOU Rui-zhe1,HOU Rui-zhi2,PENGYun-xiang2,et al.(1.Norman Bethune College of Medicine,JilinUniversity,Jilin,Changchun130021,China;2.China-Japan Union Hospital,JilinU-niversity,Jilin,Changchun130033,China)

ObjectiveTo explore p53 and ki-ras genes collaborative mutation in colorectal cancer patients.MethodsThe p53 gene and ki-ras gene expression and mutationwere detected in 58 cases of colorectal cancer patients with benign lesions,benign lesions to malignant,primary adenocarcinoma by immunohistochemical staining and PCR-SSCP method respectively.ResultsThe Expressions of P53 gene and Ki-rasgene were significantly different between benign group and malignant group.The Ki-ras gene expression of benign lesions and primary adenocarcinoma was significantly different.And in benign lesions,the expression of the P53 gene and Ki-ras gene was negatively correlated,while the malignant group and the primary adenocarcinoma showed positive correlation.The mutations between p53 gene and ki-ras gene was no significant difference in a concerted mutation.Synergistic gene mutation of p53 gene and ki-ras gene is closely related to lymph node metastasis.R=0.335,P=0.017,P＜0.05.Conclusionp53 and ki-ras gene mutation can contribute to the synergy of colorectal cancer development.Monitoring the P53 gene andKi-ras gene expression and mutation of the synergy will help the early diagnosis and prognosis in colorectal cancer patients.

p53 gene;ki-ras gene;colorectal cancer;synergistic mutation(Chin J Lab Diagn,2010,14:0917)

R735.3+4

A

1007-4287(2010)06-0917-03

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(200705391)資助。吉林大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃”項(xiàng)目(2009B71067)資助

*通訊作者

侯睿哲(1987-),男,吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院2006年級(jí)本科生,研究方向:消化道腫瘤。

2009-05-15)