浦踐一 ，趙 琪，門(mén)秀麗 #，張艷敏，張連元

（1.華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 急診科，河北唐山 063000；2.華北煤炭醫(yī)學(xué)院 病理生理教研室，河北唐山 063000）

?；撬釋?duì)大鼠肢體骨骼肌缺血再灌注后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響

浦踐一1，趙 琪2，門(mén)秀麗2#，張艷敏1，張連元2

（1.華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 急診科，河北唐山 063000；2.華北煤炭醫(yī)學(xué)院 病理生理教研室，河北唐山 063000）

目的：觀察牛磺酸（Tau）預(yù)處理對(duì)大鼠肢體缺血再灌注（IR）后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的影響。方法：制作大鼠肢體IR損傷動(dòng)物模型，將大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、IR組和Tau組，測(cè)定各組骨骼肌組織濕/干（W/D）、活性氧（ROS)、丙二醛（MDA）、黃嘌呤氧化酶（XOD)、超氧化物歧化酶（SOD）含量，采用Western blot和實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)法測(cè)定骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）蛋白-葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（GRP94)表達(dá)水平，分析牛磺酸對(duì)肢體IR損傷與ERS的關(guān)系。結(jié)果：與 IR 組比較，Tau組大鼠骨骼肌組織 ROS、MDA、XOD 和 W/D 均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），而 SOD活性顯著增加（P＜0.05），GRP94在蛋白及mRNA水平表達(dá)下調(diào)。結(jié)論：牛磺酸對(duì)肢體IR損傷的保護(hù)作用與減輕骨骼肌ERS反應(yīng)有關(guān)。

?；撬?；缺血再灌注；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；肢體

Author's addressDepartment of Emergency，The Affiliated Hospital，North China Coal Medical University，063000，Tangshan Hebei，China

肢體缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷是臨床一種常見(jiàn)的病理過(guò)程，如：斷肢再植、四肢大血管栓塞的解除或損傷的修復(fù)、嚴(yán)重的肢體擠壓傷及肢體手術(shù)時(shí)長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)用止血帶等。但迄今這種損傷的確切機(jī)制仍不十分清楚。再灌注時(shí)產(chǎn)生的氧自由基和細(xì)胞內(nèi)鈣超載可能是肢體IR損傷重要的發(fā)病環(huán)節(jié)[1]。已有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）參與了腦組織的IR損傷[2]，我們的前期工作也表明ERS反應(yīng)參與肢體缺血再灌注損傷的發(fā)生，但?；撬釋?duì)肢體IR損傷過(guò)程中ERS的影響至今尚未見(jiàn)報(bào)道。我們通過(guò)制作大鼠肢體IR損傷模型，觀察?；撬釋?duì)骨骼肌葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（glucose-regulated protein 94，GRP94）表達(dá)的影響，探討 ERS在大鼠肢體缺血再灌注損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康雄性Wistar大鼠30只，體重200～250g，隨機(jī)分成3組，每組各10只，喂養(yǎng)14d。（1）對(duì)照組：常規(guī)飼養(yǎng)；（2）缺血再灌注（IR）組：常規(guī)飼養(yǎng)；（3）?；撬幔╰aurine，Tau）組：動(dòng)物飲水含 1%?；撬幔桂B(yǎng) 14d[1]。

1.2 動(dòng)物模型復(fù)制

術(shù)前12h禁食，IR組和Tau組按本室成功構(gòu)建的方法[3]，復(fù)制動(dòng)物模型，即：乙醚淺麻醉下，用止血帶于雙后肢根部結(jié)扎，4h后松帶恢復(fù)血流灌注。對(duì)照組除了不結(jié)扎肢體外，操作同其余2組動(dòng)物。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及檢測(cè)

全部動(dòng)物于實(shí)驗(yàn)第6h末經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死，迅速取出股四頭肌，液氮冷凍保存。骨骼肌活性氧（reactive oxygen species，ROS)、 丙二醛（malondialdehyde，MDA）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD)、超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）含量測(cè)定采用比色法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作（南京建成生物制品公司）。

1.3.2 骨骼肌組織濕/干（wet/dry，W/D）的測(cè)定

取股四頭肌組織約300mg，用濾紙吸凈表面血跡后稱重，置于80℃烤箱烘干72h后取出稱干重，計(jì)算其比值。

1.3.3 骨骼肌組織GRP94 mRNA表達(dá)檢測(cè)

采用RT-PCR方法，取-80℃保存的骨骼肌組織約200mg，抽提總RNA，擴(kuò)增。引物序列：GRP94： 上 游 引 物 5＇-GACGGG CAAGGACATCTCTACAAA-3＇， 下 游 引 物 5＇-CTTCTTCTTCTGCCCCTGCGT CTG-3＇（預(yù)擴(kuò)增片段 362 bp）[4]；β-actin： 上游引物 5＇-GACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3＇，下游引物 5＇-ATAGAGCCACCAATCCACACAGAG-3＇（預(yù)擴(kuò)增片段173 bp）。 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 3min，94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 45s，35 個(gè)循環(huán)，最后 72℃延伸8min。取PCR產(chǎn)物10μl，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，采用北京航空學(xué)院圖像分析管理系統(tǒng)軟件進(jìn)行掃描。

1.3.4 骨骼肌組織GRP94蛋白的表達(dá)檢測(cè)

采用Western blot方法。取液氮凍存的各組大鼠骨骼肌組織各200mg，加入0.5 ml的組織蛋白裂解液，用勻漿器將組織研碎，4℃離心，取上清，按Bradford法測(cè)量蛋白濃度。取100μg樣本，于100℃水浴3min后上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)移法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉，分別加入GRP94一抗（1：500）和βactin一抗 （1：500），置4℃冰箱振蕩孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，加入HRP標(biāo)記的二抗（1：20 000）室溫反應(yīng)1 h，TBST洗滌后，ECL化學(xué)發(fā)光試劑于暗室中顯影，X光膠片曝光，拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析、q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨骼肌組織MDA、XOD、SOD、W/D的變化

表1示，與對(duì)照組比較，IR組骨骼肌SOD值顯著降低 （P＜0.05）， 而 ROS、XOD、MDA 和 W/D均顯著升高 （均 P＜0.01）。與IR組比較，Tau組SOD 顯著升高（P＜0.05），ROS、XOD、MDA 均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

2.2 各組大鼠骨骼肌組織GRP94 mRNA表達(dá)（圖 1）

與對(duì)照組比較，IR組大鼠骨骼肌GRP94基因表達(dá)水平上調(diào)，但Tau組GRP94基因表達(dá)水平下降，但仍高于對(duì)照組。

2.3 各組大鼠骨骼肌組織GRP94蛋白表達(dá)（圖2）

表1 各組大鼠骨骼肌組織ROS、MDA、XOD、SOD和W/D值 （n=10）

與對(duì)照組比較，IR組大鼠骨骼肌GRP94蛋白表達(dá)水平上調(diào)，但Tau組大鼠骨骼肌GRP94蛋白表達(dá)水平較IR組下降，見(jiàn)圖2。

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中重要細(xì)胞器，具有折疊、翻譯蛋白及維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)定的作用。ERS是指由于某種原因使得細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細(xì)胞器病理過(guò)程。正常情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是實(shí)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的基本條件，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有極強(qiáng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)體系。盡管如此，仍有很多因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，缺血再灌注時(shí)缺氧、酸中毒、ATP耗竭、鈣超載及大量自由基生成等均可作為誘導(dǎo)ERS的刺激因素，而氧化應(yīng)激是引起缺血再灌注損傷的重要原因，ERS在缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義[5]。GRP94也稱免疫球蛋白結(jié)合蛋白，是ERS的經(jīng)典標(biāo)志物之一，相對(duì)分子量為94 000。細(xì)胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、自由基超負(fù)荷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白的聚集均可引發(fā)ERS，使GRP94蛋白表達(dá)上調(diào)。GRP78和GRP94分子伴侶具有幫助未折疊蛋白折疊或促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白正確折疊的作用[6]。由此可見(jiàn)，GRP94表達(dá)上調(diào)是ERS的標(biāo)志之一。宋小燕等[7]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦IR后GRP78表達(dá)上調(diào)。我們以前的研究結(jié)果表明肢體IR后骨骼肌的損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[8]，本研究結(jié)果也顯示，肢體IR后4h，骨骼肌組織中ROS、MDA和XOD水平升高，而抗氧化酶SOD活性降低，說(shuō)明氧化應(yīng)激參與了肢體IR后骨骼肌的損傷，同時(shí)我們還觀察到與此同時(shí)肢體骨骼肌組織GRP94基因和蛋白表達(dá)上調(diào)，表明肢體IR可誘發(fā)骨骼肌的ERS反應(yīng)，而且骨骼肌ERS反應(yīng)可能與氧化應(yīng)激有關(guān)；與IR組比較，?；撬犷A(yù)處理后骨骼肌組織GRP94基因的表達(dá)下調(diào)，ERS減弱，同時(shí)骨骼肌組織中ROS、MDA和XOD水平降低，而抗氧化酶SOD活性升高，推測(cè)?；撬釡p輕ERS可能與其抗氧化作用有關(guān)，因此干預(yù)ERS可能為治療IR損傷提供新的靶點(diǎn)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effects of taurine on endoplasmic reticulum stress after limbs skeletal muscle ischemia-reperfusion inrats

PU Jian-yi，ZHAO Qi，MEN Xiu-li，et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital，2010 Aug，24（4）：223-225

Objective：To investigate the effect of taurine on endoplasmic reticulum stress after limbs ischemiareperfusion （IR）in rats.Methods：Making the model of limbs ischemia reperfusion injury in rats.Rats were randomly divided into 3 groups（n=10)：control group，IR group and taurine（Tau)group.The contents of reactive oxygen species（ROS)，malondialdehyde（MDA)，xanthine oxidase（XOD)，superoxide dismutase（SOD)and rario of wet/dry（W/D)of skeletal muscle in different group rats were detected.Then Western blot and real timepolymerase chain reaction were used to examine the expression change of glucose regulated protein（94GRP94）of skeletal muscle in different group rats.Results：Compared with control group，the content of ROS，MDA，XOD and W/D in skeletal muscle increased significantly in IR group.The level of SOD in skeletal muscle decreased after reperfusion.The expression of GRP94 protein and GRP94 mRNA increased significantly in IR group.And taurine can down-regulate GRP94 expression in skeletal muscle.Conclusion：The protective role of taurine on limbs IR is related to decrease endoplasmic reticulum stress in rat skeletal muscle.

taurine；ischemia reperfusion；endoplasmic reticulum stress；limb

R363

A

1001-0025（2010）04-0223-03

10.3969/j.issn.1001-0025.2010.04.010

* 本文通訊作者。

浦踐一（1975-），男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。

2010-05-05

2010-06-10