陳 平,蘭風(fēng)華*,辛 娜,張 朵,陳 勇,蘇東輝

(1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心,福建福州 350025;2.福建醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系,福建福州 350004)

人血清IgG類抗LDH-C4抗體的ELISA檢測及其意義

陳 平1,蘭風(fēng)華1*,辛 娜1,張 朵1,陳 勇1,蘇東輝2

(1.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心,福建福州 350025;2.福建醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系,福建福州 350004)

目的建立檢測人血清IgG類抗精子特異性乳酸脫氫酶(LDH-C4)抗體的ELISA法,探討人血清抗LDH-C4抗體與免疫性不育的關(guān)系。方法以重組人LDH-C4(rhLDH-C4)作為包被抗原,建立人血清IgG類抗LDH-C4抗體檢測的間接ELISA方法。應(yīng)用該方法檢測74例健康人群(正常生育組)和177例不育人群(不育組)血清IgG類抗LDHC4抗體。結(jié)果初步建立了檢測人血清IgG類抗LDH-C4抗體的間接ELISA方法。不育組血清IgG類抗LDH-C4抗體陽性率(30.51%)顯著高于正常生育組(9.46%)(P＜0.01),女性不育組陽性率(31.46%)與男性不育組(29.55%)差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)論人血清中存在著IgG類抗LDH-C4抗體,此類抗體可能與免疫性不育有密切關(guān)系。

抗精子抗體;乳酸脫氫酶C4;免疫性不育;酶聯(lián)免疫吸附測定法

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1399)

精子特異性抗原與受精和胚胎的早期發(fā)育關(guān)系密切,在精子獲能、頂體反應(yīng)、精卵識別、精子穿過透明帶、精卵融合以及受精卵分裂等過程中起重要作用[1]。其中,部分抗原(如FA-1、LDH-C4、PH-20等)在一定條件下可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的特異性自身抗體,影響精子的受精能力,從而導(dǎo)致免疫性不育。有學(xué)者用不育患者血清中提取的抗精子抗體(antisperm antibodies,ASA)對睪丸cDNA文庫表達(dá)進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)最具特征性、最有效的精子特異性抗原為精子特異性乳酸脫氫酶,即乳酸脫氫酶C4(lactate dehydrogenase C4,LDH-C4),該蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的抗生育作用已在多種哺乳動物(包括靈長類)得到驗證[2]。到目前為止,國內(nèi)外很少有人對不育患者血清中抗LDH-C4抗體水平進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測。

1 材料與方法

1.1 血清

1.1.1 不育組血清 共177份,取自2005年8月-2006年1月間就診于南京軍區(qū)福州總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心的不明原因不育患者,年齡23-50歲,男性88例,女性89例。

1.1.2 生育組血清 共74份,取自同期在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院體檢中心的體檢健康者,均已生育,年齡30-45歲,男性35例,女性39例。

1.1.3 處女血清 25份,由南京軍區(qū)福州總醫(yī)院檢驗科提供,年齡＜10歲。

1.1.4 已知陽性和陰性血清 以純化的rhLDH-C4抗原為基質(zhì),對不育患者血清行免疫印跡檢查。選取其中對rhLDH-C4反應(yīng)性較強(qiáng)的血清作為已知陽性血清。處女血清中,經(jīng)同樣方法,證實對rhLDHC4無反應(yīng)性的血清,當(dāng)作已知陰性血清。

1.2 重組hLDH-C4抗原的制備 取異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)的重組菌BL21(DE3)(帶重組質(zhì)粒pET28a-hLDHC,本室構(gòu)建)菌液1 000 ml離心,收集菌體,重懸于10 ml結(jié)合緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,10 mmol/L imidazole,pH8.0)中。加入 Triton X-100 100μ l和溶菌酶(10 mg/ml)100 μ l,并加入DNA 酶Ⅰ ,在液氮中和37℃恒溫水浴箱中反復(fù)凍融4次,以裂解菌體。4℃條件下,14 000 r/min,離心10 min收集上清。按照His-Tag融合蛋白純化試劑盒(德國Qiagen公司)說明書進(jìn)行條件優(yōu)化后,用Ni螯和層析柱對上清中的重組hLDH-C4(rhLDH-C4)進(jìn)行分離純化,用PIERCE公司蛋白定量試劑盒測定其含量。

1.3 間接ELISA方法 在微量板上,將rhLDHC4抗原用碳酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH9.6)稀釋成1 μ g/ml,每孔加 100 μ l,4℃過夜 ,用 PBST(1XPBS,0.05%吐溫-20,pH7.4,以下同)洗滌3次。用封閉液(4%BSA-PBS)于37℃封閉2 h。加入1∶100稀釋的待檢血清,并用已知陰性和陽性血清作對照,37℃1 h。洗滌后加入稀釋的HRP標(biāo)記的鼠抗人IgG抗體(SBA公司產(chǎn)品),37℃作用1 h后洗滌。加底物TMD(四甲基聯(lián)苯胺)溶液,37℃避光反應(yīng)20 min,用酶標(biāo)儀于450 nm處測定各孔的吸光度值。

1.4 酶標(biāo)抗體最適工作濃度的確定 用100 ng/ml人IgG(Sigma公司產(chǎn)品)包被酶標(biāo)板,與作一系列稀釋的酶標(biāo)抗體反應(yīng)后,在波長為450 nm處測其吸光度值(A450 nm),見在稀釋度為1∶20 000時,A450 nm約為1.0,故確定1∶20 000為酶標(biāo)抗體最適稀釋度[3]。

1.5 抗原最適包被濃度的確定 rhLDH-C4抗原分別以 0.125 μ g/ml、0.25 μ g/ml、0.5 μ g/ml、1 μ g/ml、2 μ g/ml和 4 μ g/ml濃度包被酶標(biāo)板,陰性 、陽性對照血清標(biāo)本按1∶100稀釋,酶標(biāo)抗體工作濃度為1/20 000。當(dāng)包被抗原濃度為 1.000 μ g/ml時,陽性對照的A450 nm＞0.1,陰性對照的A450 nm＜0.1,且兩者比值(2.812)最大,故選擇1 μ g/ml作為實際抗原包被。

1.6 血清標(biāo)本的檢測 用上述ELISA方法,對74份生育組血清、177份不育組男女血清中IgG類抗LDH-C4抗體水平進(jìn)行檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用 χ2檢驗(α=0.05),分別比較不育組與生育組之間的陽性率差異,以及男性不育組與女性不育組之間的陽性率差異。

2 結(jié)果

2.1 rhLDH-C4抗原的純化

1 000 ml菌液經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及純化后,得1.5ml、濃度為1.0 mg/ml的rhLDH-C4制備液。取約5 μ g純化蛋白進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳,純化蛋白僅顯示單一區(qū)帶,分子量位于45 μ與30 μ之間,與預(yù)期相符(hLDH-C4分子量約為35 μ,圖1)。

圖1 純化rhLDH-C4的聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.2 間接ELISA方法的建立

2.2.1 陽性切割值的確定

以處女組血清標(biāo)本A450 nm值的平均值加3個標(biāo)準(zhǔn)差(s)作為陽性切割值(cut-off value),A450 nm值≥陽性切割值判定為陽性,A450 nm值＜陽性切割值判定為陰性[4]。rhLDH-C4抗原以 1 μ g/ml包被,酶標(biāo)抗體工作濃度為1∶20 000,測定25例女童血清標(biāo)本的A450 nm值,計算其平均值為0.042,s為0.027,故算得陽性切割值為0.123。

2.2.2 重復(fù)性試驗

取陰性和陽性的血清標(biāo)本各一份,分別同時作4次測定,測得A450 nm值的批內(nèi)變異系數(shù)分別為8.89%和5.02%。另外,連續(xù)4天測定同一份陰性血清標(biāo)本和陽性血清,計算A450 nm值批間差異,變異系數(shù)分別為8.51%和1.92%。

2.3 血清標(biāo)本的檢測

以74例生育者血清標(biāo)本作為正常對照,用上述建立的間接ELISA方法檢測177例不育者血清IgG類抗LDH-C4抗體,陽性率為30.51%(54/177),而對照組僅為9.46%(7/74),兩組的陽性率有極顯著差異(χ2為12.57,P＜0.01)。此外,在 177例不育患者者中,男性患者陽性率為29.55%(26/88),女性患者陽性率為31.46%(28/89),陽性率差異不顯著(χ2為0.08,P＞0.05)。

3 討論

眾多的研究證實,LDH-C4抗原是影響生育過程的一種關(guān)鍵的精子特異性抗原,與精子的生成、代謝、獲能等有密切關(guān)系[5]。人工免疫LDH-C4抗原可在多種哺乳動物體內(nèi)誘導(dǎo)抗LDH-C4抗體產(chǎn)生,后者可導(dǎo)致動物的生育率明顯下降[6]。本實驗應(yīng)用純化的rhLDH-C4抗原作為包被抗原,確定了最適抗原包被濃度及陽性切割值,優(yōu)化檢測條件,初步建立了檢測人血清IgG類抗LDH-C4抗體的間接ELISA方法。試驗顯示,該法的批內(nèi)及批間差異均＜10%,具有良好的重復(fù)性。

應(yīng)用本實驗建立的ELISA方法,對不育患者血清中IgG類抗LDH-C4抗體水平進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示:男女不育組血清IgG類抗LDH-C4抗體陽性率高達(dá)30.51%,而對照組僅為9.46%,提示人血清抗LDH-C4抗體可能與不育癥具有密切關(guān)系。另外,對照組少數(shù)標(biāo)本抗LDH-C4抗體也出現(xiàn)陽性結(jié)果,可能原因是:本研究的對照組標(biāo)本均來自生育后的夫婦,其抗體陽性可能發(fā)生于孕后或生育后——既往有生育史不等于取樣當(dāng)時或其后生育力不受抗體影響。另外,不育可能與抗體滴度有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為,血清中ASA陽性需看其滴度高才有臨床意義,低滴度的ASA不影響生育[7]。換言之,低滴度的抗LDHC4抗體可能不足以完全阻斷生育。

在177例男女不育患者中,男性患者陽性率為29.55%,女性患者陽性率為31.46%,兩者無顯著差別。這項結(jié)果顯示,不管是男方或者女方產(chǎn)生抗LDH-C4抗體都可能導(dǎo)致不育。在男性方面,精液中存在抗LDH-C4抗體時,該抗體可能在男性生殖道通過抑制精子上LDH-C4的酶活性,降低男性精液的質(zhì)量,導(dǎo)致精子活力減弱、穿透力降低,從而阻礙精子在女性生殖道的穿行;在女性方面,女方生殖道分泌液(如宮頸黏液、卵泡液等)中存在抗LDH-C4抗體時,不同類型的抗體(尤其是分泌型IgA)結(jié)合到精子表面上,通過凝集或制動作用,顯著地降低精子對宮頸黏液的穿透力及精子在子宮輸卵管的運(yùn)行,從而干擾精卵結(jié)合,甚至有可能影響到受精卵的著床和發(fā)育。

本研究建立的抗LDH-C4抗體間接ELISA法與臨床上常規(guī)使用的ASA斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾檢測法進(jìn)行了初步比較(結(jié)果略),觀察到ASA斑點(diǎn)免疫膠體金滲濾檢測法陽性率低于抗LDH-C4抗體間接ELISA法,且ASA檢測陽性的標(biāo)本,抗LDH-C4抗體檢測未必一定陽性,反之亦然。由于目前臨床上ASA檢測試劑盒所用的抗原基質(zhì)是精子抗原粗提物,成分多,針對其中大部分精子抗原的ASA與免疫性不育關(guān)系不大,部分與不育密切相關(guān)的抗原成分在所用的抗原基質(zhì)中含量偏低,因此,ASA檢測的敏感性及特異性不高,檢測結(jié)果的臨床意義有限。本實驗建立的ELISA方法是以單一精子特異性rhLDH-C4作為包被抗原,僅針對血清抗LDH-C4抗體進(jìn)行檢測,避免了非特異蛋白成分的干擾,提高了檢測的敏感性及特異性。

本研究首次研究了以rhLDH-C4作為ELISA包被抗原檢測血清抗LDH-C4抗體的可行性,并首次對不育患者血清中IgG類抗LDH-C4抗體進(jìn)行檢測。由于目前國內(nèi)外尚未建立免疫性不育的診斷標(biāo)準(zhǔn),也未制備抗LDH-C4抗體的標(biāo)準(zhǔn)人血清,該方法的敏感性及特異性有待以后研究進(jìn)一步驗證。盡管如此,該方法的建立將為其它抗精子特異性抗原抗體檢測方法的建立提供有益的借鑒。

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[4]沈關(guān)心,周汝麟主編.現(xiàn)代免疫學(xué)實驗技術(shù)[M].武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社,1998.119.

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ELISA method for detection of IgG-type anti-sperm specific lactate dehydrogenase antibody in human sera and its clinical significance

CHEN Ping,LAN Feng-hua,XIN Na,et al.(ResearchCenterfor MolecularMedicine,Fuzhou General Hospital of Nanjing Command,PLA,Fuzhou,Fujian350025,China)

ObjectiveTo establish an ELISA method for the detection of IgG-type anti-sperm specific lactatedehydrogenase antibody in human sera and investigate the relationshipbetween anti-sperm specific lactate dehydrogenase antibody and immune infertility.MethodsAn indirect ELISA was established using recombinant human sperm-specific dehydrogenase(rhLDH-C4)antigen for plate coating and anti-LDH-C4 antibody(IgG type)in the sera from 74 fertile individuals(fertile group)and 177 unexplained infertile patients(infertile group)was detected.ResultsAn indirect ELISA method for detecting IgG type anti-LDH-C4 antibody in human sera was established.Of 177 infertile patients(in infertile group),54 were found positive for serum IgG type anti-LDH-C4 antibody,resulting in a positive ratio of 30.51%(54/177),which was significantly higher than that in fertile group(7/74 or 9.46%,P＜0.01).Within the infertile group,no significant difference of positive ratios were observed between female and male members(31.46%vs 29.55%,P＞0.05).ConclusionThere was IgG-type anti-LDH-C4 antibody in human sera,and this antibody might be closely related to infertility.

sperm;lactate dehydrogenase;infertility;IgG;ELISA

R446.62;R711.6

A

1007-4287(2010)09-1399-03

福建省科技攻關(guān)重點(diǎn)課題(2002Y032)

*通訊作者

陳 平(1979-),男,碩士研究生,從事免疫學(xué)研究。

2009-12-15)