陳 志,孫珉丹,宋 東,宋志宇

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130021)

氧化應(yīng)激對(duì)尿毒癥大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

陳 志,孫珉丹,宋 東,宋志宇*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130021)

*通訊作者

近年來(lái)慢性腎臟病(CKD)和腦血管病的發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì),已成為人類面臨的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。尿毒癥是各種原發(fā)或繼發(fā)的慢性腎臟疾病不斷惡化、進(jìn)展的最終階段,其中心腦血管系統(tǒng)受累最重,是影響尿毒癥患者預(yù)后的主要因素;在中樞神經(jīng)系統(tǒng),尿毒癥病人腦血管病的發(fā)病率較高,其死亡率即使在透析病人中也占據(jù)很大比率。然而,有關(guān)尿毒癥病人發(fā)生腦缺血再灌注損傷后的病理生理變化及其機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。本文以尿毒癥大鼠為研究對(duì)象,動(dòng)態(tài)觀察其發(fā)生腦缺血再灌注后腦組織中自由基含量、抗氧化能力的變化以及病理改變,從而明確尿毒癥體內(nèi)長(zhǎng)期存在的氧化應(yīng)激對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響,為臨床治療尿毒癥合并缺血性腦血管病提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠30只,體重250-280 g,實(shí)驗(yàn)室條件適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,術(shù)前自由進(jìn)食飲水,隨機(jī)分為單純尿毒癥組(CRF組)6只、尿毒癥合并腦缺血再灌注組(CRF+I/R組)24只,制備尿毒癥模型,成模后,再取同樣大鼠30只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(N組)6只、單純腦缺血再灌注組(I/R組)24只。所有4組大鼠中,除N組和CRF組外,其余兩組大鼠再制作大腦中動(dòng)脈栓塞模型。腦缺血2小時(shí)后再灌注,按再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)(0 h 、2 h、12 h、24 h)I/R 組 、CRF+I/R 組又分為4個(gè)亞組,每個(gè)亞組6只。參照文獻(xiàn)方法[2,3],制備5/6腎切除尿毒癥大鼠模型及大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞再灌注(MCAO)模型。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,手術(shù)不成功、造模失敗及24 h內(nèi)死亡的大鼠均棄之不用。用同一批次的大鼠制成合格模型后補(bǔ)足數(shù)目。

1.2 取材 每個(gè)亞組及N組、CRF組各取6只大鼠,在冰水浴中用玻璃勻漿器制成10%的腦勻漿,用離心機(jī)3 000 r/min,離心15 min,取上清液用于檢測(cè)丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。

1.3 比色法檢測(cè)腦組織勻漿中MDA、SOD 嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作(購(gòu)自南京建成生物工程研究所),并按公式計(jì)算MDA含量和SOD活力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行資料分析,所有數(shù)據(jù)以±s表示,多樣本均數(shù)比較用方差分析,兩兩比較采用SNK法,兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn),P＜0.05作為顯著性差異的界值。

2 結(jié)果

2.1 MDA、SOD的變化 與N組相比,CRF組大鼠腦組織中SOD活力降低,MDA含量升高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);與I/R組各時(shí)間點(diǎn)相比,CRF組大鼠SOD活力均升高,MDA含量下降,且均有顯著差異(P＜0.05)。發(fā)生再灌注損傷的兩組大鼠腦組織在再灌注后0-24 h之間SOD活力均呈逐漸下降趨勢(shì),MDA含量則呈上升趨勢(shì),CRF+I/R組各時(shí)間點(diǎn)SOD活力均較其余三組明顯下降,MDA含量明顯升高(P＜0.05)。(見(jiàn)表1、2)

3 討論

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn) MDA的變化(μ mol/g,±s,n=6)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn) MDA的變化(μ mol/g,±s,n=6)

▲尿毒癥組與對(duì)照組相比,無(wú)顯著差異(P＞0.05);▼缺血再灌注組各時(shí)間點(diǎn)與尿毒癥組相比,有顯著差異(P＜0.05);△尿毒癥+缺血再灌注組各時(shí)間點(diǎn)與各組相比,均有顯著性差異(P＜0.05)。下同。

組別 0 h 2 h 12 h 24 h對(duì)照組 2.12±0.49尿毒癥組▲ 2.38±0.67缺血再灌注組▼ 3.35±0.40 3.43±0.67 3.83±0.48 4.75±0.46尿毒癥+缺血再灌注組△ 5.48±0.45 5.28±0.47 6.70±0.58 7.95±0.65

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床資料都證實(shí),氧自由基(ROS)參與了腦缺血再灌注的損傷過(guò)程[4,5]。生理?xiàng)l件下,ROS的生成和清除能保持平衡,機(jī)體產(chǎn)生的少量自由基可被機(jī)體較強(qiáng)的防御系統(tǒng)所抑制,不致引起病理效應(yīng)。這些防御系統(tǒng)包括:自由基生成抑制劑,如過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)等及清除自由基的抗氧化物,如維生素C、維生素E等。病理情況下,自由基產(chǎn)生增多,而自由基清除酶活性下降,抗氧化物減少,使增多的自由基通過(guò)一系列的過(guò)氧化反應(yīng)造成組織細(xì)胞的損傷,這些損傷包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸的過(guò)氧化,其中主要損害是產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物,再經(jīng)過(guò)氧化物酶分解成丙二醛(MDA),MDA可使磷脂、蛋白質(zhì)、核酸發(fā)生交聯(lián)、變性,產(chǎn)生脂褐素堆積在細(xì)胞,促使細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞[6]。由于MDA是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,且其含量能夠體現(xiàn)組織細(xì)胞中的含量,因此常用來(lái)反映脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的程度。在自由基防御體系,SOD是主要存在于細(xì)胞漿和線粒體內(nèi)的一種金屬蛋白酶,對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用,被認(rèn)為是防御自由基的第一道防線[7],能催化O2-?轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2的歧化反應(yīng),清除引發(fā)自由基連鎖反應(yīng)的起始基O2-?。GSH-PX幾乎在所有組織中分布,是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化H2O2分解的酶,它特異地催化還原型谷胱甘肽對(duì)H2O2的還原反應(yīng)[8]。H2O2是半衰期最長(zhǎng)的,被認(rèn)為是ROS主要的氧化信號(hào)介導(dǎo)者。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[9],外源性GSH能完整通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織,一般認(rèn)為它在細(xì)胞內(nèi)能清除有害的過(guò)氧化物代謝產(chǎn)物,阻斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈鎖反應(yīng),從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。在腦內(nèi)含有高濃度的GSH-PX,幾乎不含過(guò)氧化氫酶,因此,主要通過(guò)GSH-PX來(lái)清除腦內(nèi)的H2O2。發(fā)生腦缺血再灌注后,氧一方面在黃嘌呤氧化酶作用下產(chǎn)生新的氧自由基,同時(shí)又使原來(lái)因氧耗竭而停滯的氧自由基向脂質(zhì)過(guò)氧化物轉(zhuǎn)化的過(guò)程得以繼續(xù),從而加重了細(xì)胞損傷[10]。本研究中,除正常對(duì)照組外,其余三組大鼠腦組織中MDA含量均不同程度升高,并且與再灌注的時(shí)間呈正相關(guān),相應(yīng)的SOD、GSH-PX活性在三組中都下降。其中,單純尿毒癥組大鼠發(fā)生的氧化反應(yīng)最輕,單純腦缺血再灌注組次之,而尿毒癥合并腦缺血再灌注組的氧化應(yīng)激反應(yīng)最重。尿毒癥患者體內(nèi)長(zhǎng)期處于高氧化水平已經(jīng)是一個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí),由于尿毒癥病人腎小球?yàn)V過(guò)功能、腎小管重吸收功能均不同程度喪失,導(dǎo)致體內(nèi)氧化產(chǎn)物過(guò)多積聚,氧化產(chǎn)物和還原物質(zhì)之間固有的平衡被打破,氧化過(guò)程相對(duì)占優(yōu)勢(shì),其后果之一就是動(dòng)脈粥樣硬化加重,從而發(fā)生嚴(yán)重的心腦血管事件,這也是尿毒癥病人易發(fā)生腦血管疾病的原因之一,也是尿毒癥病人合并腦血管病高死亡率的原因之一。但對(duì)于尿毒癥合并腦缺血再灌注損傷后的病理生理改變目前尚未查到文獻(xiàn)報(bào)道。在我們的研究中,單純尿毒癥組大鼠的腦組織中過(guò)氧化物的含量高于正常,其抗氧化物質(zhì)減少,活性降低,表明尿毒癥大鼠體內(nèi)長(zhǎng)期存在的氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響,只是氧化應(yīng)激的強(qiáng)度較腦缺血再灌注組弱;而尿毒癥并腦缺血再灌注損傷組大鼠腦組織受到的過(guò)氧化損害明顯重于單純腦缺血再灌注組和單純尿毒癥組,自身的抗氧化能力下降明顯,提示尿毒癥的氧化應(yīng)激加重了腦缺血再灌注損傷,表明對(duì)尿毒癥患者長(zhǎng)期給予抗氧化治療的必要性和重要性。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn) SOD的變化(U/mg)(±s,n=6)

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn) SOD的變化(U/mg)(±s,n=6)

組別 0 h 2 h 12 h 24 h對(duì)照組 239.83±16.79尿毒癥組▲ 239.50±13.05缺血再灌注組▼ 119.83±10.65 114.67±10.17 102.67±8.09 95.17±6.71尿毒癥+缺血再灌注組△ 93.00±5.93 92.17±5.31 80.83±6.49 67.67±5.16

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1007-4287(2010)09-1384-02

2009-11-18)