江漢秋,劉 群,陳 志,張 昱

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100730;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿系統(tǒng)疾病診治中心)

凝血酶致大鼠腦水腫與腦內(nèi)MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究

江漢秋1,劉 群2,陳 志3,張 昱2

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100730;2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院泌尿系統(tǒng)疾病診治中心)

目的探討凝血酶對(duì)大鼠腦內(nèi)MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)的影響。方法Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、對(duì)照組及凝血酶實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組腦內(nèi)注入凝血酶,在不同時(shí)間點(diǎn)采用干濕重法測(cè)腦水含量,Western blog方法檢測(cè)腦內(nèi)MMP-9、MMP-2蛋白的表達(dá)。對(duì)照組注入等量生理鹽水。結(jié)果腦組織水含量在凝血酶注入后12 h開始增加,3 d達(dá)高峰。MMP-9在注射凝血酶后12 h開始明顯表達(dá)增加,與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01),3 d達(dá)高峰,隨后持續(xù)下降。MMP-2在注射凝血酶后24h才開始有明顯表達(dá),后持續(xù)增多,5 d達(dá)高峰,隨后有所下降,與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。結(jié)論凝血酶在腦出血后腦水腫及腦組織損傷中起了關(guān)鍵的作用,MMP-9、MMP-2參與了急性期腦水腫過(guò)程。

凝血酶;腦水腫;MMP-9;MMP-2;腦出血

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1363)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)后腦組織損傷機(jī)理一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),但目前仍不十分清楚。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)ICH后血塊衍生物、最初的物理性損傷和血腫占位效應(yīng)是重要原因,而凝血酶(thrombin,TB)是血腫凝血反應(yīng)過(guò)程中釋放的主要物質(zhì)。本課題組已經(jīng)研究證實(shí),在大鼠腦內(nèi)注入凝血酶后,腦組織水含量增加,免疫組化初步明確了其可導(dǎo)致腦內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)和MMP-2表達(dá)增多[1]。本文將應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)大鼠腦內(nèi)注入TB后腦組織中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的變化,探討凝血酶導(dǎo)致ICH腦水腫的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性Wistar大鼠140只,鼠齡3-4個(gè)月,體重250-300 g,由長(zhǎng)春高新技術(shù)動(dòng)物中心提供。將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(20只)、對(duì)照組(60只)及凝血酶組(60只)。凝血酶組及對(duì)照組分別在術(shù)后3 h、12 h、24 h、3 d 、5 d、7 d 處死動(dòng)物,取腦。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行腦組織水含量及MMP-9、MMP-2蛋白表達(dá)檢測(cè)。各時(shí)間點(diǎn)腦組織水含量和蛋白表達(dá)檢測(cè)各5只大鼠。

1.2 動(dòng)物模型制備

用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(300 mg/kg)。取右側(cè)尾殼核為注射部位,在腦立體定位儀下,其坐標(biāo)為 R3.0 mm、A0.2 mm、H5.5mm,實(shí)驗(yàn)組注入 10 μ凝血酶+50 μ l生理鹽水(凝血酶購(gòu)自Sigma公司)。用微量進(jìn)樣器在約5min注血完畢,留針10 min。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組注入50 μ l生理鹽水,方法同上。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 腦組織水含量檢測(cè) 不同組別、不同時(shí)間點(diǎn)麻醉大鼠,斷頭處死,迅速取出腦組織,用刀片以針尖為中心取厚度約4 mm右側(cè)腦組織,立即稱濕重。將組織放入烘干箱100℃烘烤24 h,再稱干重。按Elliot公式計(jì)算腦組織水含量:腦組織水含量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.2 Western blot方法檢測(cè)MMP-9、MMP-2的表達(dá)

各組取于距血腫灶外側(cè)緣2mm左右取腦組織。蛋白定量后,進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜,加入含一抗(分別為兔抗鼠MMP-9、兔抗鼠MMP-2,均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)的反應(yīng)液,后加入含二抗反應(yīng)液(羊抗兔IgG)。結(jié)果采用國(guó)產(chǎn)HP IAS21000型圖像分析儀測(cè)定平均光密度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS16.0軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用(±s)表示。各組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 腦組織水含量

凝血酶組腦組織水含量在3 h較對(duì)照組變化不明顯,雖有升高但與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05),12 h已開始有較明顯的變化,24 h-3 d時(shí)腦組織水含量變化最明顯,3 d達(dá)高峰,與對(duì)照組相比差異非常顯著(P＜0.01),7 d時(shí)腦組織水含量明顯減少與對(duì)照組相比仍差異顯著(P＜0.01)(表1)。

2.2 各組MMP-9蛋白在不同時(shí)程的表達(dá)

在假手術(shù)組MMP-9表達(dá)量很少。3 h TB組MMP-9表達(dá)增加不明顯,與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P＞0.05),同樣在24 h開始明顯增加,3 d達(dá)到高峰,后逐漸下降,7 d時(shí)仍有較明顯表達(dá)。除3 h外各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比較差異顯著(P＜0.01)(表2)。

2.3 各組MMP-2蛋白在不同時(shí)程的表達(dá)

在假手術(shù)組MMP-2幾乎無(wú)明顯表達(dá)。腦內(nèi)注入TB后3 h已可見少量的MMP-2表達(dá),12 h出現(xiàn)了短暫性表達(dá)下降,24 h后開始增多,第3 d已可見較為明顯的陽(yáng)性表達(dá),5 d達(dá)到高峰,后開始逐漸下降。TB組各時(shí)間點(diǎn)MMP-2表達(dá)平均光密度值與對(duì)照組相比差異均非常顯著(P＜0.05)(表3)。

表1 各組腦組織水含量的比較(±s)

表1 各組腦組織水含量的比較(±s)

注:與對(duì)照組相同時(shí)間比較ΔP＜0.01,*P＜0.05。下同。

組別 3 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d假手術(shù)組 63.60±2.80對(duì)照組 72.07±2.52 76.31±3.53 79.52±2.92 73.58±1.91 69.37±2.45 67.59±2.82 TB 組 75.02±1.95 83.87±4.00Δ 90.57±2.08Δ 91.66±3.47Δ 86.75±1.09Δ 77.70±2.53Δ

表2 各組病灶周圍腦組織MMP-9平均光密度值(±s)

表2 各組病灶周圍腦組織MMP-9平均光密度值(±s)

組別 3 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d假手術(shù)組 36.09±3.68對(duì)照組 40.92±2.95 49.44±3.61 59.41±3.88 78.60±3.40 53.94±2.98 39.15±3.55 TB 組 43.31±3.22 63.04±4.68Δ 104.03±6.00Δ 183.27±7.32Δ 122.06±6.63Δ 77.16±4.94Δ

表3 各組病灶周圍腦組織MMP-2平均光密度值(±s)

表3 各組病灶周圍腦組織MMP-2平均光密度值(±s)

組別 3 h 12 h 24 h 3 d 5 d 7 d假手術(shù)組 15.80±2.17對(duì)照組 19.70±2.40 18.54±1.88 29.48±3.70 40.63±3.51 45.79±2.72 43.13±2.28 TB 組 27.48±3.46Δ 23.03±2.35* 63.74±4.11Δ 81.34±4.27Δ 103.29±5.56Δ 87.82±4.66Δ

3 討論

目前關(guān)于ICH與MMPs關(guān)系的研究還比較少,近些年來(lái)才有涉及。Power等[2]應(yīng)用凝膠原酶誘導(dǎo)ICH模型證實(shí),ICH 后MMP-2、3、7、9 mRNA 表達(dá)均升高,并參與了ICH后的炎性反應(yīng)及細(xì)胞死亡過(guò)程。在隨后,Abilleira等[3]等對(duì)ICH患者M(jìn)MP-9的改變及其是否與腦水腫有關(guān)進(jìn)行了探討。發(fā)現(xiàn)ICH患者出現(xiàn)神經(jīng)癥狀后24h內(nèi)MMP-9濃度顯著升高。深部ICH患者的MMP-9濃度與出血周圍水腫區(qū)的大小、意識(shí)障礙的加重顯著相關(guān)。這是首次發(fā)現(xiàn)人類ICH后血漿內(nèi)MMP-9濃度升高的研究。隨后Alvarez-Sab í n等[4]對(duì) ICH 患者研究發(fā)現(xiàn),MMP-9的表達(dá)增多與腦組織周圍水腫有明顯的相關(guān)性。由此可見,MMP-9、MMP-2在ICH后腦組織損傷中占有十分重要的地位,尤其MMP-9在血腫周圍腦組織水腫中具有重要的作用。

TB對(duì)ICH后腦水腫的產(chǎn)生具有重要的作用。大量的實(shí)驗(yàn)表明TB在血腦屏障(blood brain barrier,BBB)破壞過(guò)程中具有重要作用。Lee等[5]在大鼠基底節(jié)注射TB,發(fā)現(xiàn)TB可誘發(fā)明顯的腦水腫,應(yīng)用TB抑制劑水蛭素等可抑制腦水腫的形成,說(shuō)明TB在ICH腦水腫形成起重要作用。他們應(yīng)用同位素標(biāo)記的α-氨基異丁酸測(cè)定BBB通透性發(fā)現(xiàn),認(rèn)為TB的細(xì)胞毒性作用及對(duì)BBB通透性的影響是其誘發(fā)腦水腫的機(jī)制。此外,Sansing等[6]研究表明,血小板計(jì)數(shù)與腦水腫明顯相關(guān),出血部位激活的血小板釋放因子可以與TB相互作用,增加血管通透性,促進(jìn)了腦水腫的發(fā)展。Hua等[7]在鼠腦分別注入自體全血、全血加水蛭素、袋裝紅細(xì)胞、TB、生理鹽水,發(fā)現(xiàn)大鼠前肢的狀態(tài)與腦水腫呈平行關(guān)系。注入TB可引起神經(jīng)功能缺損,而水蛭素可減輕ICH后的神經(jīng)功能缺損,袋裝紅細(xì)胞可以誘發(fā)遲發(fā)的腦水腫與遲發(fā)的神經(jīng)功能缺損有關(guān)。

本研究已發(fā)現(xiàn)在TB注入12 h后開始腦組織病理?yè)p傷及腦組織水含量增加,在24 h更為明顯,3 d達(dá)到高峰。可見TB在ICH后12 h的腦水腫,尤其是24 h-3 d期間占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。ICH后的24 h-3 d期間正是BBB受損最為嚴(yán)重時(shí)期,也是腦組織神經(jīng)元變性壞死、膠質(zhì)細(xì)胞開始增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變最明顯的階段,而此時(shí)也是血腫大量釋放TB發(fā)揮作用的時(shí)間點(diǎn),故可推測(cè)TB釋放造成早期ICH的腦水腫。

本實(shí)驗(yàn)的Western blot結(jié)果證實(shí)MMP-9表達(dá)量在TB組3 h增加不明顯,同樣在24 h開始明顯增加,3 d達(dá)到高峰,后明顯下降。TB組3 h也已可見少量的MMP-2表達(dá),12 h出現(xiàn)了短暫性表達(dá)下降,24 h后開始增多,5 d達(dá)到高峰,后開始逐漸下降。從以上關(guān)于腦內(nèi)注入TB后的MMP-9、MMP-2的研究發(fā)現(xiàn),二者的表達(dá)有所不同。①?gòu)谋磉_(dá)量上看,MMP-9平均灰度值整體高于MMP-2的表達(dá);②從達(dá)到高峰的時(shí)間上來(lái)看,MMP-9只有一個(gè)高峰,是在注入TB后3 d,而MMP-2有2個(gè)高峰,即注入后3 h及5 d;③從表達(dá)的持續(xù)時(shí)間來(lái)看,MMP-2的表達(dá)持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng);

Rosenberg等[8]在SHR腦缺血再灌注損傷后3 h即見MMP-2陽(yáng)性表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞。24 h MMP-9開始有表達(dá),免疫組化48 h時(shí)可在血管內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、神經(jīng)元中觀察到MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá);而在5 d直到21 d后仍可在缺血周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞。Anna[9]等研究發(fā)現(xiàn),MMPs的表達(dá)在腦缺血后有2個(gè)高峰,即缺血后4 h有MMP-2的短暫性升高,主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá),MMP-9則在缺血后4 h-4 d主要在神經(jīng)元及髓鞘纖維束表達(dá),4 d后則為小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞內(nèi)MMP-2的表達(dá),這與隨后的Magnoni等研究結(jié)果基本相同[10]。

通過(guò)以上的結(jié)果表明,腦內(nèi)注入TB后MMP-9、MMP-2具有與ICH基本相同的表達(dá)趨勢(shì)。TB在腦組織的損傷中占有十分重要的地位,ICH后TB的釋放是ICH腦組織改變的非常關(guān)鍵的有害物質(zhì)。TB可能正是通過(guò)促使MMP-9、MMP-2的上調(diào)而發(fā)揮著毒性作用。在組織損傷早期,MMP-9發(fā)揮了主要的作用,而MMP-2可能是其在超早期發(fā)揮毒性作用的同時(shí)更主要的擔(dān)當(dāng)了組織損傷后的修復(fù)任務(wù)。

[1]江漢秋,劉 群,劉 瑾,等.凝血酶對(duì)大鼠腦內(nèi)MMP-9、MMP-2表達(dá)的影響[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志,2006,23(1):75.

[2]Power C,Henry S,Del Bigio MR,et al.Intracerebral hemorrhage induces macrophage activation and matrix metalloproteinases[J].Ann Neurol,2003,53(6):731.

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Effect of the protein expression of MMP-9 and MMP-2 in rats brain after injection thrombin

JIANG Han-qiu,LIU Qun,CHEN Zhi,et al.(Department of Neurology,Beijing Tongren Hospital of Capital Medical University,Beijing100730,China)

ObjectiveTo study effect of the protein expression of MMP-9 and MMP-2 in rats brain after injection thrombin.MethodsWistar rats were divided randomly into sham-operated group,control group and experiment group.The animals of experiment group were injected thrombin in brain.At the due time some rats were killed and brain tissue was removed to measure the water content by dry-wet weight method.The others were to measure of the protein expression of MMP-9 and MMP-2 by Western blot.The animals of control group were injected aequales liquor natrii chloridi isotonicus.ResultsThe water content of brain increased at 12 hours after injection thrombin,and peaked at 3 days.Comparedwith control group,in experiment group the expression of MMP-9were observed increasing obviously at 12 hours after injection thrombin,and peaked at 3 days,then decreased gradually.Some of MMP-2 protein were observed until 24 hours in experiment group,and peaked at 5 days,then decreased gradually,and was significantly more than control group(P＜0.01).ConclusionThrombin played a important role in intracerebral hemorrhage on cerebral edema and tissue impairment.MMP-9 andMMP-2 contributed to brain edema in the acute phase of ICH.

Thrombin;cerebral edema;MMP-9;MMP-2;ICH

R743.34

A

1007-4287(2010)09-1363-03

2010-03-14)